一种微生物酶法生产a‑酮戊二酸的方法与流程

文档序号:11809384阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种微生物酶法生产a-酮戊二酸的方法,其特征在于,生产方法的具体步骤如下:

(1)粗酶液的制备:将L-谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤,去除菌体,上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L-谷氨酸氧化酶的粗酶液;

(2)转化培养:在pH为8.5的磷酸缓冲液中,添加L-谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L-谷氨酸钠,37℃,200r/min 转化 24 h,即得含a-酮戊二酸的转化液;磷酸缓冲液的终浓度为50mmol,L-谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol,L-谷氨酸钠的终浓度为10%;

所述L-谷氨酸氧化酶的发酵液的制备方法如下:

(1)斜面培养:将菌株 MQO-160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养,培养温度为28℃,培养时间为48h;

(2)种子扩大培养:从步骤(1)的斜面培养基上挑取菌落,加水稀释获得菌体溶液,将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养,接种量为 10%(v/v),扩大培养的温度为 28℃,摇床转速 120r/min,培养时间为12h;

(3)发酵培养:将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中,接种量为10%(v/v),扩大培养温度30℃,摇床转速150r/min,发酵周期36h;

(4)30L 发酵罐培养:将步骤(3)中发酵培养后的发酵液接种到 30L

发酵罐的发酵培养基中,接种量为10%(v/v),控制罐压强为0.05MPa,在28℃条件下培养 48 小时,搅拌转速为400rpm,风量为10 L/min,发酵后得含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液;

所述菌株MQO-160的保藏编号为:CGMCC No.12892;保藏单位为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏日期为:2016 年8月22日;保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述菌株 MQO-160 的生物特性为:

菌株MQO-160的基内和气生菌丝均为乳白色,菌丝有较多的隔膜,气生菌丝有较多的枝状分支,部分菌丝处于旺盛的生长期,有芽状结构,菌株产生金黄色或紫红色可溶性色素,菌株MQO-160的孢子卵圆形、球形或柱形,表面光滑,孢子丝呈螺旋状。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述斜面培养基的配制:可溶性淀粉20g,KNO3 1g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g ,琼脂20g,加纯净水至 1L,用 NaOH 调 pH 至7.4-7.6。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述斜面培养基灭菌温度为115℃,灭菌时间为15min。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述种子培养基的配制:蔗糖30g、酵母浸膏6g、(NH4)2SO46g、CaCO3 30g、CaCl2 3g、MgCl2·6H2O 1g、KCl 1g,加纯净水至 1L,用 NaOH 调 pH 至 7.0。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述种子培养基的灭菌温度为115℃,灭菌时间为15min。

7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基的配制:葡萄糖30g,玉米浆干粉20g,蔗糖30g,酵母膏 1g, (NH4)2SO410g,谷氨酸钠 10g,MgCl2 0.5g,KCl 0.5g,NaH2PO40.5g,用自来水配成 1L 溶液,用 NaOH 调 pH 至 7.0。

8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基的灭菌温度为121℃,灭菌时间为20min。

9.如权利要求1-8任一项所述方法生产的a-酮戊二酸的分离纯化方法,具体步骤如下:

离子交换:将含有a-酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈,用0.25N盐酸溶液洗脱;

纳滤:采用600-800分子量纳滤膜过滤a-酮戊二酸洗脱液纯化液得到a-酮戊二酸纳滤清液,用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后,弃去浓缩液,收集含瓜氨酸产品的纳滤透析液;

活性炭脱色:pH 3.0,用活性炭进行脱色,活性炭的用量为a-酮戊二酸纳滤清液的1%(质量分数),脱色温度为50℃,脱色时间为30min,用0.22μm滤膜过滤得脱色液;

反渗透浓缩:将a-酮戊二酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到a-酮戊二酸预浓缩液;

浓缩结晶:将预浓缩液在真空度≥0.095,蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液,将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h;

干燥:结晶结束后,抽滤获得晶体,将结晶晶体50℃真空干燥,得到a-酮戊二酸成品。

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