硫代二酮哌嗪类化合物及其应用的制作方法

本发明涉及微生物医药技术领域，具体的说是从海洋真菌Penicillium brocae的发酵菌丝体中分离纯化的硫代二酮哌嗪类化合物及其应用。

背景技术：

海洋微生物次级代谢产物具有丰富的结构多样性和显著的生物活性，是药物先导化合物的重要来源。硫代二酮哌嗪类化合物是一类主要由真菌产生的具有生物活性的化合物，其分子结构中都含有带硫桥的二酮哌嗪母核，具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫抑制等。研究发现，硫代二酮哌嗪可以作为缺氧诱导因子(HIF-1α)抑制剂阻止HIF-1α与转录共激活因子(CBP/p300)的结合，成为靶向抗肿瘤药物研究的热点化合物之一。

前期研究发现，海洋红树林植物白骨壤茎的内生真菌Penicillium brocae MA-231在PDB培养基静置发酵培养中，可以代谢产生一系列硫代二酮哌嗪衍生物，表现出较强的抗肿瘤活性，具有潜在药用价值，进一步研究发现该菌株在优化培养条件下可以代谢产生结构丰富多样、抗肿瘤活性显著的硫代二酮哌嗪类化合物。

技术实现要素：

本发明的目的在于从海洋真菌Penicillium brocae的发酵菌丝体中分离纯化的硫代二酮哌嗪类化合物及其应用。。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种硫代二酮哌嗪类化合物，硫代二酮哌嗪类化合物分子式是C₁₈H₁₈O₅N₂S₂，如式I所示：

一种硫代二酮哌嗪类化合物的应用,所述式I所示硫代二酮哌嗪类化合物在制备卵巢癌药物中的应用。

一种硫代二酮哌嗪类化合物的应用,所述式I所示硫代二酮哌嗪类化合物在在制备抑制金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。

本发明所具有的优点：

本发明从采自海南新盈红树林白骨壤茎中分离获得一株青霉属 真菌Penicillium brocae，该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年1月17日，保藏号为：CGMCC NO.8736，对其进行培养条件优化，从其查氏培养基摇床发酵产物中发现一个结构新颖的具有显著抗肿瘤活性的硫代二酮哌嗪类化合物，目前尚未见对该化合物的化学结构及抗肿瘤、抗菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。

经体外抗肿瘤活性试验，该化合物对卵巢癌细胞A2780的敏感株和顺铂耐药株均有显著抑制活性，其半数抑制浓度(IC₅₀)分别为664.2和660.6nM。另外，抗菌活性测试发现该化合物对金黄色葡萄球菌也具有较强选择性抑制活性，其最小抑制浓度(MIC)为0.25μg/mL。可用于制备治疗上述癌症和金黄色葡萄球菌感染引起的疾病的药物。

附图说明

图1A为不同浓度下式I所示化合物对卵巢癌细胞A2780敏感株抑制活性的变化。

图1B为不同浓度下式I所示化合物对卵巢癌细胞A2780顺铂耐药株抑制活性的变化。

具体实施方式

以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。

在如下的实施例中所指的化合物化学结构是(结构式中的阿拉伯数字式化学结构中的碳原子的标位)：

实施例1.化合物发酵生产及分离精制：

本发明所用海洋真菌Penicillium brocae分离自海南红树林植物白骨壤茎中，纯化后培养在查氏培养基上，查氏培养基配方为：葡萄糖36g,甘露醇24g，硝酸钠3.5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁0.02g，硫酸镁0.7g，谷氨酸钠3g，酒石酸钠1.5g，海盐17.5g，蒸馏水1000ml。

采用发酵罐大量发酵菌株Penicillium brocae MA-231，菌丝体用丙酮-水(80-20(v/v))超声破碎提取3-4天，合并提取液后旋蒸除去丙酮，水相用乙酸乙酯萃取3-4次，合并萃取液再进行浓缩，获得菌丝体粗提物。

粗提物进行减压硅胶柱(200-300目)层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1(v/v)二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱(流速200ml/min)。收集二氯甲烷-甲醇20:1(v/v)得到的洗脱组分，进行反相柱层析(以甲醇-水作为洗脱液梯度洗脱，洗脱梯度范 围为甲醇-水20:80到80:20，v/v，流速为1.5ml/min)，收集甲醇-水60：40(v/v)洗脱得到的组分，再用硅胶柱层析纯化，以100:1至10:1(v/v)的二氯甲烷-甲醇洗脱(流速3ml/min)，收集二氯甲烷-甲醇50:1(v/v)洗脱得到的组分即得纯化目标化合物。

其结构鉴定为如(I)所示，

该化合物具有以下理化和波谱特性：

淡黄色无定形粉末，[α]_D²⁵－100.0(c 0.22,MeOH)；UV(MeOH)λmax(logε)204(3.65),269(3.14)nm；核磁共振氢谱和碳谱如表I；ESI质谱m/z 407[M+H]⁺,高分辨ESI质谱m/z 407.0728[M+H]⁺，C₁₈H₁₉O₅N₂S₂计算值为407.0730。

表I化合物的核磁共振氢谱和碳谱(500MHz，in CDCl₃)数据

a)本表信号归属基于DEPT、¹H-¹H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果，碳信号的多重度利用DEPT方

法确定

实施例2.抗肿瘤活性。

采用方法为MTT，肿瘤细胞株为卵巢癌细胞A2780敏感株和顺铂耐药株。

操作步骤如下：准确称量上述实施例中制备的纯品化合物样品，用二甲基亚砜(DMSO)配制成所需浓度的溶液。

取对数生长期的肿瘤细胞，细胞密度调至2×10⁵个细胞/毫升，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5％二氧化碳的培养箱中培养4小时。样品分别设定5个浓度梯度10^-8，10^-7，10^-6，10^-5和10^-4mol/L，每个浓度设三个平行样，每孔加样品液或空白液各2微升，培养48小时， 然后每孔加浓度为5毫克/毫升的MTT液10微升，继续培养4小时，出去上清液。每孔加入DMSO各100微升，在微量震荡器上震荡10分钟，至结晶完全溶解后，酶标仪测定每孔570纳米出的吸光值(OD值)。取三孔平均OD值，按IR％＝(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照×100％式计算样品对细胞增殖的抑制率(IR％)。结果参见图1。

由图1实验结果显示化合物对卵巢癌细胞A2780的敏感株和顺铂耐药株均有显著抑制活性，其半数抑制浓度(IC₅₀)分别为664.2和660.6nM。实施例3.抗菌活性。

采用最小抑菌浓度(MIC)法检测式I所示化合物抗金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的活性。

实验过程如下：采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至11孔加样品溶液，每孔5μL，第12孔不加样品作为生长对照。

将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml)稀释1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至11孔的样品终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于37℃培养箱中，培养24小时。

在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低药物浓度为MIC。当阴性对照孔内指示菌明显生长时试验才有意义。

实验结果显示该化合物对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制活性，其MIC为0.25μg/mL。

上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对卵巢癌细胞和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制活性，可作为抗肿瘤制剂或抗菌剂，并有望以任何可接受的盐或添加临床可接受的辅料或载体如赋形剂、稀释剂的形式在制备相关药物中得到应用。