具有免疫原性的模拟金黄色葡萄球菌LTA表位的多肽及其应用的制作方法

本发明涉及一种多肽及其应用，特别涉及一种模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。

背景技术：

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种寄居于人体皮肤和粘膜的革兰氏阳性菌，是社区和院内感染的主要病原体。伴随抗生素广泛应用，金葡菌感染率在发达国家已经超过40% [1]，近十年来耐药菌株（如耐甲氧西林、耐万古霉素等）出现使临床用药面临严峻考验，如2013年我国CHINET细菌耐药性监测结果显示金葡菌中甲氧西林耐药株的平均检出率高达45.2% [2]。在应对上述挑战中，人们对免疫学防治金葡菌感染寄予希望，然而迄今为止针对金葡菌不同成分的10余种疫苗尚无一被批准临床应用 [3]，具体表现为：（1） 荚膜多糖交联载体疫苗是胞外菌多糖疫苗的最常用类型，但针对金葡菌荚膜多糖疫苗StaphVAX已经失败，原因在于约有20%金葡菌临床分离株缺失荚膜多糖，以此疫苗候选免疫后部分个体不能产生保护性抗体；（2）以致病因子和表面蛋白作为疫苗靶标：多采用重组表达蛋白技术，表达相应细菌蛋白成份，如金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）突变体、铁表面决定子B（IsdB）等；（3）灭活全菌疫苗SA75因诱导保护性反应差而终止。

现有疫苗主要针对金葡菌各种致病因子。但金葡菌致病因子众多（多达50种以上），不同致病因子在细菌感染不同时期发挥不同作用 [4]；而且金葡菌可以逃避机体免疫系统对其杀伤和识别。单纯选择金葡菌致病蛋白作为靶点进行疫苗研制有一定局限性。因此选择稳定表达于金葡菌表面、保守性结构作为疫苗候选成为现阶段金葡菌疫苗研究的方向。

脂磷壁酸（LTA）是金葡菌及其它革兰氏阳性菌的保守成份。由磷酸二脂键连接的磷酸甘油残基与一个膜载体共价连接的线性聚合物 [5]。脂磷壁酸无种属特异性，广泛表达于金葡菌、链球菌、粪球菌等革兰氏阳性菌细胞壁表面，是维持细菌细胞壁完整结构的重要成份 [6,7]；同时还是细菌表面重要粘附分子，参与细菌对宿主细胞的粘附作用；脂磷壁酸可作用于树突状细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞导致促炎性细胞因子（如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素8等）分泌，介导细菌感染后脓毒症发生 [8]。然而常规并不将此分子作为疫苗候选，原因在于脂磷壁酸是糖脂类成份，属于非胸腺依赖性抗原，单纯以此分子作为疫苗不能诱导有效免疫记忆以及良好免疫应答。已有研究表明合成的线性肽以及在线性肽基础上合成的多价抗原肽可有效模拟病原体中的糖脂类结构，以这些模拟糖脂的合成肽作为疫苗候选，能诱导机体产生针对相应病原体的保护性效应，包括特异性抗体和细胞免疫应答[9-15]。由此可以预见，能够模拟脂磷壁酸表位的多肽(包括线性肽和多价抗原肽)有助于开发出新的、有效的金黄色葡萄球菌疫苗以及诊断性试剂。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，以该多肽作为免疫原免疫小鼠，可诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染，从而该多肽可作为用于研发新的金葡菌疫苗。

本发明人通过筛选，得到一条可模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其序列如下：VHWDFRQWWQPS（SEQ ID NO：1），记为L3（为便于检测，N端标记生物素）。以此核心序列合成线性肽L3-1（为便于检测，N端标记生物素，序列为Biotin-HSVHWDFRQWWQPSGGGS（SEQ ID NO：2））和改变N端V为G氨基酸残基、合成的线性肽L3-2（为便于检测，N端标记生物素，序列为Biotin-HSGHWDFRQWWQPSGGGS（SEQ ID NO：3））；同时以L3-1序列合成四分枝多价抗原肽(即在四分枝多聚赖氨酸支架上包含四条HSVHWDFRQWWQPSGGGS)，记为MAP3。酶联免疫吸附实验表明L3、L3-1、L3-2以及四分枝多价抗原肽MAP3与抗多种革兰氏阳性菌脂磷壁酸的单克隆抗体结合；以MAP3作为免疫原免疫小鼠，MAP3免疫组小鼠在金葡菌系统性感染后肾脏和肺脏细菌残存量显著低于对照肽免疫组和空白组。

本发明所采取的技术方案是：

一种模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其核心氨基酸序列为VHWDFRQWWQPS或GHWDFRQWWQPS（SEQ ID NO：4）。

可选的，该多肽序列的一端至少连接有不超过5个氨基酸的保护肽。

进一步的，该多肽核心氨基酸序列的N端连接有两个氨基酸HS。

进一步的，该多肽核心氨基酸序列的C端连接有GGGS。

进一步的，该多肽序列为HSVHWDFRQWWQPSGGGS或HSGHWDFRQWWQPSGGGS。

一种免疫原，该免疫原上偶联有模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，多肽的序列如上所述。

免疫原上偶联有多条模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。

免疫原由多聚赖氨酸支架和偶联在其上的模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽组成。

本发明的有益效果是：

1)本发明所提供的模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，具有较好的抗原性，即能与针对多种革兰氏阳性菌脂磷壁酸的单抗隆抗体特异性结合。说明这种多肽能良好模拟脂磷壁酸保守性表位，未见同类报道。

2)本发明所提供的模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，作为免疫原免疫小鼠，能诱导小鼠抵御金葡菌系统性感染。所述序列有望开发为新型的、具有保护性效果的金黄色葡萄球菌疫苗以及诊断性试剂。

附图说明

图1是线性肽L3与抗脂磷壁酸单抗的结合情况；

图2 是线性肽L3-1与抗脂磷壁酸单抗的结合情况；

图3 是线性肽L3-2与抗脂磷壁酸单抗的结合情况；

图4 是四分枝多价抗原肽MAP3结构模式图；

图5是 MAP3与抗脂磷壁酸单抗的结合情况；

图6 是MAP3免疫小鼠可降低金葡菌系统性感染后肾脏（A）和肺脏(B)细菌残存量。

具体实施方式

一种模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，其核心氨基酸序列为VHWDFRQWWQPS或GHWDFRQWWQPS。

可选的，该多肽的序列的至少一端连接有不超过5个氨基酸的保护肽。更佳的，连接的氨基酸不超过4个。保护肽的作用在于更好地维持核心多肽的稳定性，避免其结构被破坏而失效。同时，保护肽的存在也利于将核心肽偶联在其他半抗原上，以提高其免疫原性。

进一步的，该多肽核心氨基酸序列的N端连接有两个氨基酸HS。

进一步的，该多肽核心氨基酸序列的C端连接有GGGS。

进一步的，该多肽序列为HSVHWDFRQWWQPSGGGS或HSGHWDFRQWWQPSGGGS。

一种免疫原，该免疫原上偶联有模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽，多肽的序列如上所述。

进一步的，免疫原上偶联有多条模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽。如2条，3条、4条或更多。以进一步提高其免疫原性。

进一步的，免疫原由多聚赖氨酸支架和偶联在其上的模拟金黄色葡萄球菌脂磷壁酸表位的多肽组成。

线性肽L3与抗脂磷壁酸单克隆抗体（MA1-7401）特异性结合

根据序列VHWDFRQWWQPS合成线性肽L3（序列:Biotin-VHWDFRQWWQPS），酶联免疫吸附实验表明线性肽L3与抗脂磷壁酸的单克隆抗体（MA1-7401）特异性结合（图1）。说明L3模拟脂磷壁酸表位。

酶联免疫吸附实验具体方法：以抗LTA单抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶标板，4℃孵育过夜，酪蛋白封闭液（200μl/孔）封闭 37℃ 2小时，洗板后加入L3合成肽（500μg/ml），37℃孵育1小时，洗板后加辣根过氧化物酶标记的亲和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分钟，洗板后加底物显色。测OD450nm。

线性肽L3-1与抗脂磷壁酸单克隆抗体特异性结合

在L3序列基础之上，为使VHWDFRQWWQPS序列更稳定，分别在L3序列N端加入HS两个氨基酸残基，C端加GGGS四个氨基酸残基，合成肽命名为L3-1，序列为Biotin-HSVHWDFRQWWQPSGGGS。酶联免疫吸附实验表明L3-1与抗脂磷壁酸单抗（MA1-7401）呈剂量依赖性结合（图2），说明L3-1保持L3合成肽的抗原性，模拟脂磷壁酸表位，同时说明核心序列VHWDFRQWWQPS序列模拟脂磷壁酸表位。

酶联免疫吸附实验具体方法：以抗LTA单抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶标板，4℃孵育过夜，酪蛋白封闭液（200μl/孔）封闭 37℃ 2小时，洗板后加入不同浓度L3-1合成肽，37℃孵育1小时，洗板后加辣根过氧化物酶标记的亲和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分钟，洗板后加底物显色。测OD450nm。

线性肽L3-2与抗脂磷壁酸单克隆抗体（MA1-7401）特异性结合实验

在L3-1序列基础上，用G氨基酸残基替换N端V氨基酸残基，合成线性肽。序列为Biotin-HSGHWDFRQWWQPSGGGS（命名为L3-2）。酶联免疫吸附实验结果表明L3-2仍保持与抗脂磷壁酸单克隆抗体结合（见图3），说明L3-2肽模拟脂磷壁酸表位。

具体实验方法：以抗LTA单抗MA1-7401（5μg/ml，50μl/孔）包被酶标板，4℃孵育过夜，酪蛋白封闭液（200μl/孔）封闭 37℃ 2小时，洗板后加入不同浓度L3-2合成肽，37℃孵育1小时，洗板后加辣根过氧化物酶标记的亲和素（HRP-Avidin），37℃孵育30分钟，洗板后加底物显色。测OD450nm。

四分支多价抗原肽与抗LTA单抗（MA1-7401）特异性结合实验

与线性肽相比，四分支多价抗原肽的优势是分子量大、在体内稳定、不易被降解，是良好的疫苗候选。为后续检测多肽是否可以模拟LTA表位并可以作为疫苗候选免疫实验动物，根据L3-1线性肽序列合成四分支多价抗原肽MAP3（含四分支多聚赖氨酸支架，每一支架上连接一条HSVHWDFRQWWQPSGGGS，结构模式图见图4）。结果显示抗LTA单抗特异地与MAP3结合（图5），说明四分支多价抗原肽MAP3并未改变原始线性肽L3-1的构象，依然可以模拟LTA表位，可用于后续免疫动物。

具体实验步骤：以不同浓度MAP3包被酶标板 4℃ 过夜孵育，洗板后加入酪蛋白封闭液（200μl/孔）37℃ 封闭2小时，洗板后加入MA1-7401（5μg/ml）37℃孵育40分钟，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体 37℃孵育40分钟，洗板后底物显色，测OD450nm。

免疫小鼠实验

具体实验步骤：随机将BALB/c小鼠分为3组，分别免疫MAP3、对照MAP（MAPctrl）和空白对照组（blank, 无免疫组）。以MAP3或MAPctrl为免疫原，100μg/只免疫小鼠，共免疫五次，间隔时间为3周、2周、2周、2周、2周。末次免疫后7天，静脉注射金葡菌（2×10⁷ CFU/只），感染3天后取小鼠肾脏和肺脏，研磨，离心后测脏器研磨液中细菌残存量。结果显示MAP3免疫组小鼠肾脏和肺脏细菌残存量显著低于MAPctrl组和空白对照组（图6）。提示MAP3作为LTA替代物免疫小鼠后，可保护小鼠抵御金葡菌系统性感染。因此MAP3有望作为金葡菌疫苗候选。

<110> 南方医科大学南方医院

<120> 具有免疫原性的模拟金黄色葡萄球菌LTA表位的多肽及其应用

<130>

<150> CN2016102968514

<151> 2016-05-05

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

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