敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因、发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法与流程

本发明属于微生物突变的基因工程，及其利用所构建的菌株发酵提高特定化合物产量的方法。

背景技术：

聚酮类化合物是由细菌、真菌、植物以及动物所产生的次生代谢物的一个种类，其形式极其繁多，在天然产物中具有不可替代的作用，新药开发潜力和商业价值巨大。聚酮化合物洋橄榄叶素是一种具有C₂-对称性的十六元环大环内二酯类抗生素，在Streptomyces sp.DSM4137、S.melanosporus、S.hygroscopicus var.azalomyceticus和S.violaceoniger(Tu 905)等链霉菌的次级代谢产物中均有发现。洋橄榄叶素具有抗革兰阳性菌、抗线虫、抗原生动物、免疫抑制和抗哺乳动物肿瘤细胞等多种生物学活性。Streptomyces sp.DSM4137中洋橄榄叶素可能的生物合成基因簇已经克隆，其生物合成包括聚酮合成和糖组分的合成。

自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus CGMCC 0516)是我们从西双版纳原始森林的土壤中采集并分离得到的一株放线菌新种(ZL 00134063.8，保藏编号为CCTCC M 2015580)，它能够通过微生物代谢途径产生多种抗病毒和抗肿瘤活性化合物，其中包括格尔德霉素和洋橄榄叶素及其衍生物—11-氧-甲基洋橄榄叶素及11,11′-氧-二甲基洋橄榄叶素。但作为代谢产物的格尔德霉素在参与链霉菌活性生物合成中影响了洋橄榄叶素及其衍生物的合成，降低了产量，敲除其调控基因以提高后者的产量是所需亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明旨在于提供一种能够大量产生洋橄榄叶素及其衍生物的基因工程方法，它首先旨在提供一种敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法，其次，旨在提供一种利用敲除该基因的菌株发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

(一)敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法

所述方法是：敲除自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)almRIII基因以获得突变株，该自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏编号为CCTCC NO：M 2015580。

进一步地，所述的方法包括以下步骤：

(1)采用Red/ET一步PCR法，以质粒pHY773为模板，通过PCR扩增获得两端带有与almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒；PCR扩增的引物为：

5′-TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′和

5′-GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′；PCR扩增条件为：94℃预热2分钟，1个循环；94℃变性45分钟，62℃复性45秒，72℃扩增2分钟，31个循环；72℃扩增10分钟；4℃1小时；

(2)通过电转化把所扩增片段导入含pIJ790和almRIII基因粘粒质粒的Escherichia coli大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素抗性的转化子，该转化子即为含有插入突变的almRIII基因；

(3)用上述转化子制备含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中；

(4)利用接合转移把含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子，即自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株。

进一步地，所述的方法：采用PCR和Southern杂交验证突变株为敲除almRIII基因的自溶链霉菌突变株：

(1)PCR扩增制备Southern杂交探针，PCR引物为：5′-GCGAGTTGCGCCGGCGCGGGGTACG-3′和5′-CAGAACCGCGGCGCCGACGGCATC-3′，PCR扩增条件为：94℃预热2分钟，1个循环；94℃变性45分钟，62℃复性45秒，72℃扩增2分钟，31个循环；72℃扩增10分钟；4℃1小时；

(2)制备自溶链霉菌almRIII突变株DNA及野生型菌株的基因组DNA，DNA经限制性内切酶BamH I完全酶切，电泳后转移至硝酸纤维素膜，与上述探针进行Southern杂交。

(二)利用以上敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因提高洋橄榄叶素及衍生物产量的发酵方法

包括以下步骤：

(1)用MS培养基培养自溶链霉菌almRIII基因突变株的新鲜孢子，接种新鲜孢子至TSB培养基制备发酵种子液；

(2)接种发酵种子液至发酵培养基，于28℃、250rpm发酵培养；该发酵培养基组分为：2％豆粉，0.2％蛋白胨，2％葡萄糖,0.5％可溶性淀粉，0.2％酵母浸膏，0.4％NaCl，0.05％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄，0.2％CaCO₃；

(3)收集发酵液上清，用乙酸乙酯抽提两次，经硅胶柱层析及半制备HPLC纯化，得到洋橄榄叶素及其衍生物的纯品。

进一步地，所述的发酵方法是：将步骤(3)纯品于45℃减压蒸干、溶于甲醇，用HPLC分析或/和用质谱和¹H、¹³C核磁共振确认化合物结构。

本发明构建的自溶链霉菌almRIII基因突变工程菌命名为自溶链霉菌TL561(△almRIII)Streptomyces autolyticus TL561(△almRIII)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2015580，保藏日期：2015年10月8日。

如图2～3，采用HPLC进行分析和洋橄榄叶素及其衍生物结构经质谱和¹H、¹³C核磁共振分析确认，本发明的有益效果是：

本发明所构建almRIII基因敲除突变株产洋橄榄叶素及其衍生物的产量为662.3mg/L，与野生型中的242.2mg/L相比，本发明产量为野生型的2.73倍以上，产量大幅提高。为此，本发明通过敲除格尔德霉素生物合成基因簇中的调控基因almRIII改造了自溶链霉菌野生型菌株遗传性质，大幅降低了菌株格尔德霉素的产量，同时大幅度提高了洋橄榄叶素及其衍生物的产量，为洋橄榄叶素及其衍生物的生物医药工程创造了崭新途径。

附图说明

图1为自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株的构建策略。其中，BamH I是酶切的野生型菌株基因组DNA；BamH I是酶切的突变株基因组DNA。

图2为自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株的琼脂糖凝胶分析图。图中，1.2kb为野生型扩增的结果，1.9kb为突变株扩增的结果。

图3为自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株的Southern杂交分析图。图中，0.73kb为野生型杂交的结果，0.38kb为突变株杂交的结果。

图4为野生型菌株发酵产物的自溶链霉菌almRIII基因的检测。其中，I：洋橄榄叶素；II：11-氧-甲基洋橄榄叶素；III：11,11′-氧-二甲基洋橄榄叶素。

图5为敲除突变株的产物的自溶链霉菌almRIII基因的检测。其中，I：洋橄榄叶素；II：11-氧-甲基洋橄榄叶素；III：11,11′-氧-二甲基洋橄榄叶素。

图6为洋橄榄叶素的结构式。

图7为洋橄榄叶素的一个OH被OCH3取代的11-氧-甲基洋橄榄叶素衍生物结构式。

图8为洋橄榄叶素的两个OH被OCH3取代的及11,11′-氧-二甲基洋橄榄叶素衍生物结构式。

以下通过具体实施方式及实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围不限于此。实施例中所提到的制备、转化、接合转移、电泳和Southern杂交等过程，如无特殊说明，则采用本领域的常规方法均可实现，作为与本发明记载的并列方法不再赘述。

具体实施方式

(一)敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法

实施例1：

按照图1自溶链霉菌almRIII基因(SEQ ID NO：1)敲除突变株的构建策略：敲除自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)△almRIII基因以获得突变株，该自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏编号为CCTCC NO：M 2015580。

实施例2：

采用Red/ET一步PCR法构建almRIII基因的插入突变(图1)。在此方法中，首先以pHY773为模板，采用PCR扩增两端带有与almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。

PCR扩增的引物为：

5′-TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′(SEQ ID NO：2)和

5′-GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：3)，PCR扩增条件为：94℃预热2分钟，1个循环；94℃变性45分钟，62℃复性45秒，72℃扩增2分钟，31个循环；72℃扩增10分钟；4℃1小时。然后通过电转化把PCR扩增片段导入含pIJ790和almRIII基因粘粒质粒的大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素抗性的转化子，获得含有插入突变的almRIII基因。从上述转化子中制备含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中。利用接合转移把含有插入突变的almRIII基因导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子，即可能的自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株。

实施例3：

采用Southern杂交验证自溶链霉菌almRIII敲除突变株。

首先通过PCR扩增制备Southern杂交探针，PCR引物为：5′-GCGAGTTGCGCCGGCGCGGGGTACG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-CAGAACCGCGGCGCCGACGGCATC-3′(SEQ ID NO：5)，PCR扩增条件为：94℃预热2分钟，1个循环；94℃变性45分钟，62℃复性45秒，72℃扩增2分钟，31个循环；72℃扩增10分钟；4℃1小时。然后制备自溶链霉菌almRIII突变株及野生型菌株的基因组DNA，DNA经限制性内切酶BamH I完全酶切，电泳后转移至硝酸纤维素膜，以上述探针进行Southern杂交验证自溶链霉菌almRIII敲除突变株，结果如图2～3。

(二)自溶链霉菌野生型菌株及almRIII基因敲除突变株发酵产物的检测

实施例4：

自溶链霉菌野生型菌株及almRIII基因敲除突变株的新鲜孢子分别接种至50mL TSB液体培养基中，于28℃、200rpm培养36小时制备发酵种子液，然后以1％的接种量接种0.5mL种子液至发酵培养基中，该发酵培养基组分为：

2％豆粉，0.2％蛋白胨，2％葡萄糖,0.5％可溶性淀粉，0.2％酵母浸膏，0.4％NaCl，0.05％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄，0.2％CaCO₃。

于28℃、250rpm发酵培养7天。

发酵液3500×rpm离心，30分钟，取上清，用乙酸乙酯抽提两次，使用旋转蒸发仪蒸干。然后通过正向硅胶进行划段，用纯氯仿，氯仿/甲醇40:1；20:1；15:1；9:1四种比例及纯甲醇梯度洗脱。在获得出峰时间为24.4min，26.6min及28.4min样品的粗样后，首先通过凝胶柱，根据分子量大小的不同，将其它的化合物先去除掉，随后使用反向硅胶柱，用乙腈/水(7:3；8:2；9:1)三种比例及纯乙腈进行洗脱，将这三个化合物分开。将含有这3个化合物的组分利用半制备HPLC，以乙腈/水(7:3；8:2；9:1)及纯乙腈，流速3ml/min进行制备，最后得到这三个化合物的纯品。

实施例5：

发酵产物经旋转蒸发仪45℃减压蒸干后溶于适量甲醇，并采用HPLC进行分析(图5)。洋橄榄叶素及其衍生物结构经质谱和¹H、¹³C核磁共振分析确认(图6～8)。所构建almRIII基因敲除突变株产洋橄榄叶素及其衍生物的产量为662.3mg/L，与野生型中的242.2mg/L相比大幅提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南大学

<120> 敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因、发酵提高洋橄榄叶素及衍生物

产量的方法

<130> 说明书

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 自溶链霉菌 (Streptomyces autolyticus)

<400> 1

atggtccccc gaagcccgtc ggtcaatgag gagttgcgcc gccgatccca agtccgtctg 60

ctggacgcga cggtcgagct gatcggcgag cacggctatg aggcgaccac cctcgccgat 120

atcgccgacc gggccggagc ggcccgcggc ctggtctcgt actacttccc gggcaagcgg 180

cagctgctcc agacggccgt ccaccggctg atgcacatgg agctggcccg ggggctcgag 240

cgggagccgc gtccggaggg cgagggcgcc gggcgggagc tgctggcgcg ggcgatcgac 300

gcgatcctcg ggctggcccg ggaccggccg cggctgatgc gcacgcatat ggccgggatc 360

ctcacggccg agggcttcat ccagtgcccc gagcagcagc ggctggccgg tctgctgcgg 420

gacaccgtca cgcggtacgg ctcggaggac cccgagaccg actaccggct gctgcgcgcc 480

ctgctgatgg gcgcggtggt cgcggtgctg ctgccgggcg cgccgatgcc gcccgagcgg 540

ctgcgggcgg agctgttcca ccgctatgga ctggactggg agcttggact cccgccgggc 600

gaggagccgc ccgacgggag tcgatga 627

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tattggctga cagccagcca acgcaggagt tacagcatga ttccggggat ccgtcga 57

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcccgtcc ctcacccatg agtcacctct gagtgctcat gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人共序列

<400> 4

gcgagttgcg ccggcgcggg gtacg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagaaccgcg gcgccgacgg catc 24