技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在缩减基因组的枯草芽孢杆菌中表达黑曲霉葡糖苷酶的方法。
背景技术：
纤维素是全球最丰富的自然资源之一，纤维素的利用对地球的可持续发展具有重要的意义。利用宿主表达纤维素酶，是现在的研究热点之一。
芽孢杆菌是食用安全菌之一，在芽孢杆菌内部表达纤维素酶，不仅在发酵生产中能降解纤维素，提高发酵产品的产量，而且芽孢杆菌是益生菌，不需要通过分离手段除去芽孢杆菌。因此，在芽孢杆菌内表达纤维素酶具有重要意义。
芽孢杆菌在特定环境下，一些基因的表达对芽孢杆菌不具有任何意义。因此，敲出芽孢杆菌的非必需基因是提高芽孢杆菌代谢效率的最要手段。
一般在芽孢杆菌内部表达纤维素酶是以整合质粒的方式实现的，整合质粒整合进芽孢杆菌基因组，其中的筛选标记或整合的过多基因都成为代谢的负担。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种在缩减基因组的枯草芽孢杆菌中表达黑曲霉葡糖苷酶的方法；本发明的目的还在于一种表达黑曲霉葡糖苷酶的枯草芽孢杆菌工程菌。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种在缩减基因组的芽孢杆菌中表达黑曲霉葡糖苷酶的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示的DNA序列通过限制性内切酶SalI和DNA连接酶连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的同源重组质粒转化枯草芽孢杆菌KCTC1028，筛选同源重组成功的菌株。所述的载体优选为pUC18载体。
一种表达黑曲霉葡糖苷酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过上述方法得到。
本发明在缩减基因组的枯草芽孢杆菌中表达葡糖苷酶，不但可以避免所缩减的蛋白对葡糖苷酶表达的干扰，使葡糖苷酶稳定表达，还使枯草芽孢杆菌的生长速率得到提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、材料
质粒pUC18、枯草芽孢杆菌KCTC1028、E.coli实验室保存，限制性内切酶购买于Takara。SEQ ID NO.1所示的DNA序列1（包含上游同源臂、启动子、信号肽编码序列、葡糖苷酶基因、终止子、下游同源臂）由生物公司合成。
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，双蒸水定容至1000mL，调节pH为7.2。
LB固体培养基：在LB液体培养基中加入2%的琼脂。
溶液I：50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCI，10mmol/L EDTA。低温保存。
溶液II：配制2% SDS、0.4mol/L NaOH母液，按照1:1的比例混合，最终得到终浓度为0.2mol/L NaOH、1% SDS。溶液II要现用现配。
溶液III：称取29.4g乙酸钾与11.5mL冰醋酸混合，加水溶解，定容至100mL，此步骤应在通风橱内完成。低温保存。
破菌缓冲液：将1g SDS、0.121g Tris、0.585g NaCl、0.037g Na2EDTA·2H2O、20mL Triton X-100用水溶解，配制成终浓度为100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、2%（v/v）Triton X-100、1%（w/v）SDS的溶液，调节pH 8.0。
EB溶液（10mg/mL）：1g嗅化乙锭（EB）溶于100mL去离子水中，磁力搅拌器搅拌至溶解，置于铅箔包裹的棕色瓶中室温保存。
TE溶液（pH8.0）：50mmol/L Tris-HC1溶液（pH8.0）200mL和0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2mL，加水定容至1000mL。
二、方法
1、pUC18质粒的提取
（1）含有质粒pUC18的大肠杆菌斜面，用接种环单菌落，接入到装有5mL LB液体培养基（10µg/mL氨苄霉素）的试管中，于37℃、220 rpm培养过夜。
（2）取1.5mL菌液于离心管中，10000rpm离心2min后弃上清液。向含有菌体的离心管中加入100µL溶液I，漩涡震荡。再加入200µL溶液II（现用现配），轻轻颠倒混匀，并放于冰上静置4min。
（3）向上述离心管中继续加入150µL溶液III，轻轻颠倒混匀，并放置于冰上3min。
（4）13000rpm离心5min，将上清液400µL转移到另一个离心管中。按照体积比1:1的比例加入酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）400µL，漩涡震荡混匀后于最大转速下离心8min，吸取上清液到另一个干净的EP离心管中。
（5）加入40µL 3mol/L NaAC溶液和900µL无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置15min。
（6）13000rpm离心5min，将上清液转移到另一个离心管中。
（7）加入1mL 70%乙醇，颠倒几次，经过13000r/m离心5min，弃掉上清液，让离心管中的酒精和水分缓慢挥发。
（8）加入50µL TE溶解核酸，漩涡震荡后保存于-20℃冰箱中。
2、pUC18质粒和SEQ ID NO.1所示DNA序列1的酶切、连接
（1）pUC18质粒或DNA序列1的酶切
pUC18质粒或DNA序列1用限制性内切酶SalI酶切。酶切体系如下：双蒸水34µL，酶切缓冲液4µL，限制性内切酶SalI 1.5µL，pUC18质粒或DNA序列1 0.5µL。37℃水浴酶切12h。
（2）酶切片段的纯化
1）电泳
用0.5×TAE缓冲液配制0.7-1%琼脂糖凝胶，加热溶解琼脂糖，待冷却至约60℃时，混匀后将胶导入制胶模具中，在室温下凝固变硬。
轻轻的拔去模具上的梳齿，将琼脂糖凝胶放如己装有0.5×TAE缓冲液的电泳槽内，使缓冲液液面高于凝胶，凝胶加样孔一端朝向电泳槽的阴极一端。将DNA样品和上样缓冲液以5:1的比例进行混匀，然后用移液枪加入脂糖凝胶的加样孔中，最后在样品旁边预留出来的加样孔中加入DNA Ladder。加样完毕后，将电泳槽的上盖盖好，电压设定为160V，时间为35min左右，点击开始按键。
等电泳结束后，凝胶在EB溶液中染色10-15min，用凝胶成像仪观察和分析形成的DNA区带。
2）切胶回收
使用上海生工的柱式胶回收试剂盒进行纯化回收。将需要进行分离的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳使目的条带与杂带分开。照胶的面板上用手套衬于胶的下方，在护目屏放置好以后开启紫外灯，操作时双手戴乳胶手套。然后使用干净的盖玻片切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶块，放入1.5mL离心管中，称重。每100 mg琼脂糖加500µL的比例加入适量的Buffer B2，然后将离心管置于50℃水浴加热10min，混匀直至胶块完全溶化。将溶化好的液体全部转移到吸附柱，8000rpm离心30 sec，然后倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入500µL的Wash Solution，9000rpm离心30sec，然后倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。将空吸附柱和收集管放入离心机中，以9000rpm转速离心1min以去除残余的液体。在吸附膜中央加入50µL预热的Elution Buffer，室温静置2min，9000rpm离心处理1min。所得到的DNA溶液置于-20℃保存。
（3）酶切片段的连接
连接体系为：酶切回收的DNA序列1 8µL，酶切回收的pUC18质粒2µL，T4 DNA连接酶4µL，缓冲液2µL，双蒸水4µL。漩涡震荡充分混匀，离心，除去气泡。连接体系放于22℃的金属浴上过夜连接，连接产物备用。
3、大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）利用接种针挑取平板上的DH5α单菌落，接入到含有5mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜培养。按照 1%（体积比）接种量转接到含有50mLB液体培养基的三角瓶中，在37℃条件下培养5h。
（2）将100mL的聚丙烯离心管放于冰上预冷，将菌液转移到预冷的聚丙烯离心管中，然后在冰上放置10min，使离心管中的液体降至0℃。
（3）将离心管放于离心机中，并于4℃、4000rpm离心10min。
（4）在无菌条件下，快速倒出培养液，减少菌体的流失。
（5）将50mL已预冷的0.1mol/L CaC12溶液倒入带有菌体的100mL离心管中，小心重悬细胞沉淀，将离心管置于冰上20min。
（6）将离心管放于离心机中，并于4℃、4000rpm离心10min。在无菌条件下，快速倒出培养液，减少菌体的流失。将0℃的0.1mol/L CaCI2和70%甘油溶液加入到离心管中，使甘油终浓度为20%，重新悬浮菌体放置于冰上。
（7）在无菌条件下将感受态细胞分装到已经预冷的离心管中，每支约为200µL，放置于-80℃冰箱保存。
4、大肠杆菌的转化
（1）从-80℃冰箱中取出已制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上5-10min使其融化。
（2）将适量的上述连接产物（DNA量小于100ng）加入到冰浴融化的200µL感受态细胞中，用手指轻轻弹匀，放于冰上30min。
（3）将混有DNA的感受态细胞的离心管放于42℃金属浴中，进行90秒热击，然后快速转移到冰上复苏3-5min。
（4）将37℃预热的LB培养基加入到感受态细胞中，震荡混匀后放于37℃摇床中，培养50min。
（5）培养结束后，将离心管放于离心机中在6000rpm转速下离心1min，弃掉大部分上清，用剩余培养液约100µL将菌体重悬，涂布于含10µg/mL氨苄霉素的LB平板上。
（6）待平板上的菌液被吸干后，置于37℃恒温培养箱中倒置培养平板过夜。挑取单菌落培养后，提取质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的质粒命名为pUC18-E。
5、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和pUC18-E质粒的转化
从枯草芽孢杆菌KCTC1028斜面上取一环菌，接入装有10mL LB液体培养基的25mL试管中，200 r/m、30 ℃培养16 h。吸取500µL菌液，加入5mL LB液体培养基中，200r/m、37℃培养2h。吸取700µL菌液，加入5mL LB液体培养基中，200r/m、37℃培养1.5h。1.5mL培养的菌液5000r/m离心2min，弃去上层液，加入1.5mL 10%葡萄糖溶液，震荡重悬菌体，5000r/m离心4min，弃去上层液，加入1.5mL 10%葡萄糖溶液，震荡重悬菌体，得到感受态细胞。
将2µL待转化质粒pUC18-E与200µL枯草芽孢杆菌感受态细胞混匀后在37℃静置1h。然后37℃、200r/m震荡培养3h，取40µL菌悬液涂布于含10µg/mL氨苄霉素的LB固体培养基平板，37℃培养18h左右。生长的单菌落培养后提基因组进行PCR鉴定，具体如下：
基因组提取：用移液枪头挑取平板上的单菌落，接入到装有5mL LB液体培养基的试管中，于37℃、220rpm振荡培养过夜。取1mL菌液于EP管中，10000rpm离心1min，弃去培养液。加入200µL的破菌缓冲液、0.3g石英砂，漩涡振荡3min然后加入0.2mL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）漩涡震荡1min左右。加入TE缓冲液0.2mL，漩涡振荡混匀。在12000rpm转速下离心8min，用移液枪取上清（大约200µL）至一个洁净的EP管中。向上清液中加入20µL 3M NaAC和900µL无水乙醇，然后置于-20℃静置30min。将离心管于13000rpm离心5min，弃上清。加入70%乙醇1mL，洗涤沉淀，12000rpm离心8min，弃上清，基因组DNA自然风干。
PCR鉴定所用引物：正向引物：AGCTTACTCCAGAGTTATGTATTA，反向引物：GCTATTTCACCTCAACATTAAAGTAG。正反向引物在枯草芽孢杆菌出发菌株之间的距离有100kb以上；若正反向引物之间的基因组被敲除置换成葡糖苷酶基因，PCR产物为6kbp左右。
PCR反应体系为：10×Buffer 5µL，dNTPs 5µL，正向、反向引物（10pM）各2µL，基因组1µL，DNA聚合酶1µL，ddH2O补至50µL。PCR反应程序为：94℃ 10min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸8min，30个循环；72℃延伸20 min。
所得PCR产物进行电泳，片段长度在6kb左右的为目标转化子，片段长度大于6kb的为非目标转化子。所筛选得到的目标转化子命名为BS231菌株。
6、BS231菌株葡糖苷酶酶活的测定
将BS231菌株接种于LB斜面37℃培养24h左右，再用接种环挑取菌落接种至装有30mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，100r/m、37℃培养24h左右。取培养液测定葡糖苷酶酶活，酶活为1.68U/mL。该结果进一步表明，葡糖苷酶基因成功置换了枯燥芽孢杆菌的大片段基因组，使枯燥芽孢杆菌能够表达葡糖苷酶。
葡糖苷酶酶活测定方法，参照文献（张立霞等，纤维素分解菌的筛选及其不同组合对秸秆降解的效果。饲料工业，2013年22期）。
7、BS231菌株生长速率的测定
取出保藏的菌种枯燥芽孢杆菌出发菌株或构建的基因工程菌株BS231，利用接种针在LB平板固体培养基上划线，培养箱过夜培养，待长出单菌落以后，将平板上的单菌落挑出转接到5mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12h。然后以2%的接种量转接到装有50mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，在37℃的摇床中培养，转速控制在220rpm，菌体生长8h时，测定菌液的OD600。出发菌株的OD600为0.86，BS231菌株的OD600为0.91，表明所构建的基因工程菌能更快速的生产，同时产生葡糖苷酶。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。