敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因、发酵提高洋橄榄叶素及衍生物产量的方法与流程

文档序号:12249224阅读:来源:国知局

技术特征:

1.敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因的方法,其特征在于:敲除自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)almRIII基因以获得突变株,该自溶链霉菌(Streptomyces autolyticus)保藏编号为CCTCC NO:M 2015580。

2.根据权利要求1所述的方法,包括以下步骤:

(1)采用Red/ET一步PCR法,以质粒pHY773为模板,通过PCR扩增获得两端带有与almRIII基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒;PCR扩增的引物为:

5′-TATTGGCTGACAGCCAGCCAACGCAGGAGTTACAGCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′和5′-GGGCCCGTCCCTCACCCATGAGTCACCTCTGAGTGCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′;PCR扩增条件为:94℃预热2分钟,1个循环;94℃变性45分钟,62℃复性45秒,72℃扩增2分钟,31个循环;72℃扩增10分钟;4℃1小时;

(2)通过电转化把所扩增片段导入含pIJ790和almRIII基因粘粒质粒的Escherichia coli大肠杆菌中,筛选阿泊拉霉素抗性的转化子,该转化子即为含有插入突变的almRIII基因;

(3)用上述转化子制备含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒,通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中;

(4)利用接合转移把含有插入突变的almRIII基因的粘粒质粒导入野生型自溶链霉菌中,筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子,即自溶链霉菌almRIII基因敲除突变株。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:采用PCR和Southern杂交验证突变株为敲除almRIII基因的自溶链霉菌突变株:

(1)PCR扩增制备Southern杂交探针,PCR引物为:5′-GCGAGTTGCGCCGGCGCGGGGTACG-3′和5′-CAGAACCGCGGCGCCGACGGCATC-3′,PCR扩增条件为:94℃预热2分钟,1个循环;94℃变性45分钟,62℃复性45秒,72℃扩增2分钟,31个循环;72℃扩增10分钟;4℃1小时;

(2)制备自溶链霉菌almRIII突变株DNA及野生型菌株的基因组DNA,DNA经限制性内切酶BamH I完全酶切,电泳后转移至硝酸纤维素膜,与上述探针进行Southern杂交。

4.利用如权利要求1~3所述之一种敲除自溶链霉菌野生型菌株的almRIII基因提高洋橄榄叶素及衍生物产量的发酵方法,其特征在于:

(1)用MS培养基培养自溶链霉菌almRIII基因突变株的新鲜孢子,接种新鲜孢子至TSB培养基制备发酵种子液;

(2)接种发酵种子液至发酵培养基,于28℃、250rpm发酵培养;该发酵培养基组分为:2%豆粉,0.2%蛋白胨,2%葡萄糖,0.5%可溶性淀粉,0.2%酵母浸膏,0.4%NaCl,0.05%K2HPO4,0.05%MgSO4,0.2%CaCO3

(3)收集发酵液上清,用乙酸乙酯抽提两次,经硅胶柱层析及半制备HPLC纯化,得到洋橄榄叶素及其衍生物的纯品。

5.根据权利要求4所述的发酵方法,其特征在于:将步骤(3)纯品于45℃减压蒸干、溶于甲醇,用HPLC分析或/和用质谱和1H、13C核磁共振确认化合物结构。

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