用于表达恒河猴干扰素γ的载体和系统的制作方法

本发明涉及抗病毒药物领域，更特别地，涉及用于表达恒河猴干扰素γ的载体和系统。

背景技术：

恒河猴(也叫普通猕猴)原产于印度北部、孟加拉、巴基斯坦、尼泊尔、缅甸、泰国、阿富汗、越南和中国南部。该物种是世界各国用于科学试验的重要品种，甚至是太空之旅的参与者。我国将恒河猴列入国家二级保护动物，《中国国家重点保护野生动物名录》和《中国濒危动物红皮书》易危物种。

然而随着生态及环境变化、动物迁移与与行为的改变和微生物由于环境的选择造成的变异，以及生态环境变化增加了人与恒河猴等野生动物接触的机率，使新发传染病不断出现。2006年至2009年期间，我国广西、湖北、云南等地养猴场、动物园和灵长类实验动物中心暴发多起无明显季节性的群体性恒河猴、食蟹猴感染类似麻疹样疾病。研究结果，表明此次大规模猴群发病为与CDV中国狐狸EF042819.1遗传关系最近的麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)跨种感染所致，而不是变异的麻疹病毒所致犬瘟热的暴发对猴群构成的严重的威胁。由于爆发疾病的猴饲养厂是中国实验动物常用的猴源，对相关的科学研究工作的开展造成困难。发明人同期从患病的恒河猴分离得到CDV病毒，并且制备了脏器灭活苗、分离强毒的灭活苗和弱毒苗，为该病的防制提供了有效手段。

干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-γ对机体免疫系统具有强大的调节作用，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分。

IFN-γ能够诱导细胞产生数种具有酶活性的抗病毒蛋白(AVP)，干扰病毒的基因转录或病毒蛋白质的翻译。IFN-γ与细胞表面特异性受体结合后，可诱导细胞内产生具有酶活性的抗病毒蛋白。此外，IFN-γ通过提高细胞表面MHC-Ⅱ类分子的表达，有助于向T细胞提呈抗原，引起靶细胞的溶解，可以增强NK细胞、巨噬细胞对病毒的杀伤和吞噬作用，抑制病毒在新感染的细胞内的复制。

目前动物干扰素在兽医临床上的应用还处于初级阶段，只用于一些常见的难以治愈的病毒性传染病，一般用于紧急应急，当接种某一疫苗后而免疫效力还未产生的一段时间内，辅助接种干扰素会起到紧急防治病毒性传染病的效果。对于恒河猴的干扰素-γ而言，GENBANK上已经公开了恒河猴干扰素-γ的氨基酸序列和基因序列(序列号为NM_001032905，编码序列长度为495bp(SEQ ID NO:3)，编码165个氨基酸(SEQ ID NO:4))，但是，时下尚未有人建立一个能高效表达恒河猴干扰素γ蛋白的生物表达系统。

因此，需要一种新的生物表达系统来高效表达恒河猴干扰素γ蛋白，获得具有抗病毒活性的恒河猴干扰素γ，以期可用于恒河猴的一些病毒性疾病的预防和治疗。

技术实现要素：

为了解决以上问题，发明人通过分析，发现N端的前20个氨基酸为信号肽序列，用于帮助蛋白的分泌，而非蛋白结构所需，由于后续研究需要在原核生物中表达，真核生物的信号肽在原核细胞环境中由于缺少相应受体而不能发挥作用，因此去掉信号肽序列，剩下165个氨基酸(SEQ ID NO:2)，其编码序列长度为435bp(SEQ ID NO:1)。此外，为了使该基因能够顺利地在原核细胞中表达，发明人对该编码序列进行了密码子优化(图1)。

基于此，本发明提供了一种用于表达恒河猴干扰素γ的载体，其包含原核启动子和顺着所述原核启动子的转录方向连接于所述原核启动子下游的重组恒河猴干扰素γ基因，所述重组恒河猴干扰素γ基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述原核启动子为可诱导启动子，例如IPTG可诱导启动子。通过使用可诱导启动子，可先将细胞培养至高浓度，然后再进行诱导表达，使得不会因为在生长过程中表达蛋白质而影响细胞的生长。

优选地，所述用于表达恒河猴干扰素γ的载体通过将所述重组恒河猴干扰素γ基因的序列插入表达质粒pET32α的多克隆位点处得到。

优选地，所述重组恒河猴干扰素γ基因的序列插入于NdeI与XhoI之间。

pET32α是专门用于原核表达的质粒载体，其上有IPTG可诱导启动子，可在IPTG的诱导下表达插入于其下游的多克隆位点的基因。

本发明还提供了一种用于表达恒河猴干扰素γ的系统，所述系统通过将上述用于表达恒河猴干扰素γ的载体导入原核表达宿主中得到。

优选地，所述原核表达宿主为用于表达的经遗传改造的大肠杆菌，例如BL21(DE3)。这样的大肠杆菌专门为原核表达而设计，可进行高效表达。

本发明还提供了一种用于表达恒河猴干扰素γ的方法，使用上述系统表达恒河猴干扰素γ，然后将提纯所述恒河猴干扰素γ。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

S1：将所述表达系统培养至对数期，然后使用IPTG诱导表达恒河猴干扰素γ，离心收集细胞；

S2：对所收集的细胞进行超声破碎，提取粗制包涵体，洗涤，并制备成变性恒河猴干扰素γ溶液，然后使所述变性的恒河猴干扰素γ进行复性，并进行微孔过滤，即得到纯化的复性恒河猴干扰素γ。

进一步地，S2包括以下步骤：

S2.1：超声破碎，将S1中收集的细胞用PBS重悬，在冰浴下，400W功率超声10s间隔10s，反复80次后，离心弃上清，得到的沉淀即为粗制包涵体；

S2.2：用浓度为2M的尿素溶液重悬所述粗制包涵体，12000rpm离心15min，弃上清，并用浓度为8M的尿素重悬沉淀，于30℃水浴充分溶解所述沉淀，离心后上清即为变性恒河猴干扰素γ溶液；

S2.3：将所述变性恒河猴干扰素γ溶液加入透析袋中，于4℃下依次放入含4M、2M、1M、0.75M、0M的PBS溶液中透析，每个浓度梯度透析2h，得到复性恒河猴干扰素γ溶液，将所述复性恒河猴干扰素γ溶液用0.45μm孔径的滤膜过滤，得到纯化的复性恒河猴干扰素γ溶液。

通过使用本发明的载体、系统和方法，可高效表达并得到高纯度的恒河猴干扰素γ，由此得到的恒河猴干扰素γ可用于预防和治疗恒河猴的一些病毒性疾病。

附图说明

图1为优化序列与原始序列的对比图；

图2为优化后序列密码子的在大肠杆菌中的适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)；

图3为优化后序列最优密码子使用频率(Frequency of Optimal Codons,FOP)；

图4为优化后序列GC碱基含量(GC curve)；

图5为重组原核表达质粒pET32α-MaIFN-γ的双酶切鉴定(NdeI+XhoI，质粒载体片段5.4kb，目的条带约447bp)；

图6为重组恒河猴干扰素γ原核表达的SDS-PAGE电泳照片；

图7为重组恒河猴干扰素γ的可溶性鉴定照片；

图8为组恒河猴干扰素γ纯化效果SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.重组恒河猴干扰素γ的基因优化及全基因合成

根据从Genbank上检索到的恒河猴干扰素γ的核酸序列(序列号为NM_001032905)，编码区序列长度为495bp，经分析恒河猴干扰素γ的N端1-20aa为信号肽，经分析，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽序列，非蛋白结构所必须。由于后续研究需要在原核生物中表达，真核生物的信号肽在原核细胞环境中由于缺少相应受体而不能发挥作用，因此去掉信号肽序列，剩下165个氨基酸(SEQ ID NO:2)，其编码序列长度为435bp(SEQ ID NO:1)。此外，为了使该基因能够顺利地在原核细胞中表达，发明人对该编码序列进行了密码子优化(图1)。将恒河猴干扰素γ的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码恒河猴干扰素γ的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌喜欢的密码子，旨在提高基因在大肠杆菌的表达水平，优化后序列密码子的在大肠杆菌中的适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)为0.98(图2)，通常CAI＝1.0说明该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，因此可以看出经过密码子优化后的恒河猴干扰素γ基因在大肠杆菌表达系统中能够高效表达。

最优密码子使用频率(Frequency of Optimal Codons,FOP)：由图3可知，通过密码子优化，本发明优化的恒河猴干扰素γ基因在大肠杆菌表达系统中出现低利用率密码子的频率较低，小于5％。

GC碱基含量(GC curve)：GC含量理想的分布区域为30％-70％，尤其以40％-60％最为理想。本发明优化的恒河猴干扰素γ基因GC含量为46.9％(图4)，能够在大肠杆菌中高效表达。

在优化序列的5’和3’端加上NdeI、XhoI酶切位点，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并连入原核表达质粒pET32α中，得到重组原核表达质粒pET32α-MaIFN-γ，重组质粒进行酶切检测(图5)。

2.原核表达

(1)测序鉴定正确的阳性质粒pET32α-MaIFN-γ转入BL21(DE3)，挑取单菌落进行双酶切鉴定；

(2)阳性重组菌的诱导表达：将重组阳性菌BL21-pET32a-IFN-γ划线接种于LB培养皿上，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种于接种于4ml(含50μg/ml氨苄青霉素)LB培养液中，37℃180r/min摇菌过夜。按1％的比例将过夜培养的菌液接种于含100μg/ml氨苄青霉素LB中，于37℃180r/min摇菌振荡，培养3h至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入0.5mmol/L IPTG进行诱导表达，分别收集摇床培养2、4、6、8、10的菌液各1ml，将收集的菌液用PBS反复洗涤3次，对菌体超声后进行SDS-PAGE分析，以确定最佳诱导表达时间(图6)。

3.大肠杆菌表达的恒河猴干扰素γ蛋白的可溶性鉴定

取经IPTG诱导的菌液，12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清，沉淀经PBS洗涤三次后超声波破碎，破碎条件为功率400W，工作10s，间隔10s，反复80次。离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以鉴定目的蛋白的可溶性，目的蛋白主要表达于包涵体中图(7)；

4.重组恒河猴干扰素γ的提取

(1)菌体破碎：离心收集诱导后的菌体，PBS洗涤三次，超声破碎细胞，涂片镜检，观察破碎效果，弃上清，得到粗制的包涵体；

(2)包涵体的洗涤：用2M的尿素洗涤包涵体，4℃，12000rpm，离心15min，弃上清；

(3)包涵体的变性：用8M的尿素重悬沉淀，30℃水浴充分溶解包涵体，离心取上清，既得变性蛋白液；

(4)目的蛋白的透析复性：将变性蛋白液加入透析袋中，分别放入含4M、2M、1M、0.75M、0M尿素的PBS溶液中进行透析，每个溶度4℃搅拌透析2h，所得蛋白液离心，上清用直径0.45μm滤膜过滤除菌及杂质，既得重组恒河猴干扰素γ蛋白，进行SDS-PAGE电泳检验纯化结果(图8)，用BCA法测定蛋白浓度；

5.重组恒河猴干扰素γ抗病毒活性测定

Vero细胞接种24孔板，接种密度1.5×10⁵个/孔，继续培养24h，加入10倍倍比稀释的重组恒河猴干扰素γ，每个稀释度做3个重复，培养24h后弃上清，用10TCID50的犬瘟热病毒(CDV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的重组恒河猴干扰素γ，不加病毒)、阳性对照(只加病毒，不加重组恒河猴干扰素γ)、空白对照(不加重组恒河猴干扰素γ，不加病毒)。倒置荧光显微镜下逐日观察细胞病变，待阳性对照孔出现75％病变时判定结果。

实验结果表明：(1)阴性对照孔细胞生长与空白对照一致，说明本发明得到的干扰素对细胞本身没有毒害作用；(2)经稀释100倍的重组恒河猴干扰素γ能够100％抑制细胞病变，而10⁴稀释的重组恒河猴干扰素γ出现细胞病变，得出重组恒河猴干扰素γ具有抗CDV感染的活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。