具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA‑A蛋白模拟表位肽、模拟表位肽组合物及其应用的制作方法

文档序号:12162228阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽,其特征在于:所述模拟表位肽是由12个氨基酸残基构成的短肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示:

SEQ ID NO:1:His-Thr-Glu-Gln-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Lys-Met-Pro;

SEQ ID NO:2:Ser-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Glu-Arg-Met-Lys-Pro-Gly。

2.根据权利要求1所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽,其特征在于:编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1的所述模拟表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:3所示,编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2的所述模拟表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:4所示:

SEQ ID NO:3:cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg;

SEQ ID NO:4:agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。

3.一种含有权利要求1中所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的组合物,其特征在于:该组合物由SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽按2:1的质量比组合获得。

4.一种含有权利要求1中所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的模拟表位串联肽,其特征在于:该模拟表位串联肽为采用基因工程技术将SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽进行串联表达获得,串联方式为:SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接头-SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接头-SEQ ID NO:2所示多肽。

5.根据权利要求4所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的组合物,其特征在于:编码前述免疫保护性模拟表位串联肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示:

SEQ ID NO:5:cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。

6.权利要求1所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。

7.权利要求3所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽组合物在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。

8.权利要求4所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的模拟表位串联肽,在制备金黄色葡萄球菌多表位疫苗中的应用。

9.一种金黄色葡萄球菌多表位疫苗,其特征在于,该多表位疫苗中含有权利要求1所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽。

10.一种如权利要求1或2所述的具有免疫保护性的金黄色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模拟表位肽的筛选方法,包括以下步骤:

S1、以rFnBPA-A纯化蛋白为免疫原,制备兔抗FnBPA-A抗体;所述兔抗FnBPA-A抗体的制备过程为:将浓度为1mg/mL的rFnBPA-A纯化蛋白和Tween-80混匀作为水相,再加入司本白油并在漩涡振荡器上反复震荡乳化,所述rFnBPA-A纯化蛋白、Tween-80、司本白油的体积比为1:0.042:3.126;接着于实验兔的颈部、背部皮下多点注射乳化好的免疫原,免疫剂量为1mg/只,一免后第14天进行二免,二免剂量和免疫途径同一免,二免后第10天进行三免,三免无免疫佐剂,三免剂量和免疫途径与一免相同;于三免后32天采集兔血并分离得到兔血清以获得所述兔抗FnBPA-A抗体;

S2、所述兔抗FnBPA-A抗体的纯化:采用硫酸铵分级沉淀法粗提取所述兔血清中的IgG,经透析除盐后使用Protein G亲和层析柱纯化IgG以获得纯化的兔抗FnBPA-A抗体;

S3、利用所述纯化的兔抗FnBPA-A抗体对噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选,淘选使用的所述噬菌体随机十二肽库试剂盒的库容量为2.7×109、滴度为1.5×1013/μL、Escherichia coli ER2537为肽库的宿主菌;所述淘选过程为:用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO3溶液将纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释至100μg/mL,包被酶标孔,4℃过夜;次日,用TBST洗涤液洗涤6次,再加入5%BSA封闭液,37℃封闭1h,所述TBST洗涤液中含0.5%Tween-20,之后弃封闭液,将原始肽库、TBST洗涤液、纯化后的阴性血清以10:195:195体积比混匀后按照100μL/孔加入酶标孔,温和震荡1h;再弃酶标孔内液体,使用TBST洗涤液洗涤6次后用0.2mol/L、pH2.2的甘氨酸-HCl洗脱缓冲液洗脱与兔抗FnBPA-A抗体特异性结合的噬菌体,并加入1mol/L、pH9.1的Tris-HCl缓冲液中和;取5μL所述洗脱缓冲液进行噬菌体滴度测定,其余噬菌体侵染宿主菌E.coli ER2738进行扩增,用于下一轮淘选,共进行四轮淘选以获得亲和力更高的特异性噬菌体阳性克隆;四轮淘选过程中逐轮降低纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释浓度、逐轮增加所述TBST洗涤液中Tween-20的浓度,其中第四轮淘选中所述纯化后的兔抗FnBPA-A抗体稀释浓度为50μg/mL,第四轮淘选中所述TBST洗涤液中Tween-20的浓度增加到0.5wt%;

S4、所述特异性噬菌体阳性克隆DNA测序以及表位肽分析:使用噬菌体DNA单链提取试剂盒提取所述特异性噬菌体阳性克隆的单链DNA,并对所述单链DNA样品进行DNA测序,根据所述单链DNA样品中携带的外源基因序列,推导出展示于噬菌体表面的FnBPA-A蛋白模拟表位肽序列。

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