一种细菌性阴道病的LH‑PCR细菌基因指纹图谱的制备方法及应用与流程

技术特征：

1.一种LH-PCR细菌基因指纹图谱的制备方法，其中所述细菌为阴道内细菌，所述基因为16S rRNA基因。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其是对扩增片段长度310-380bp的基因片断的LH-PCR特征峰进行Kruskal Wallis Test检验。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中当片段长度340-374bp中的任何一个片断的相对峰面积大于10％时，确定为有细菌性阴道病致病菌群存在；当片段长度340-374bp中所有片段的相对峰面积都小于10％，确定为没有细菌性阴道病致病菌群存在。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中LH-PCR的引物为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM荧光标。

5.根据权利要求4所述的制备方法，包括以下步骤：

1)提取阴道分泌物的细菌基因组DNA；

2)对细菌基因组DNA中的16S rRNA基因进行PCR扩增：

3)引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，和

4)5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'端用FAM荧光标记；

5)PCR的反应体系(50μL)：10×缓冲液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL，BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O补足50μL；同时设置不添加模板的阴性对照；

6)反应程序：95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后于4℃恒温保存；

7)毛细管电泳LH-PCR产物：

8)将所述PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行富集，收集300-400bp的片断；然后用Qiagen凝胶回收纯化，并与Hi-Di甲酰胺及GS500Liz内部尺寸标准混合，混合物在PCR仪中在95℃下变性5min，再进行毛细管电泳检测，注射时间为10s，注射和运行电压为15.0kV，运行温度为60℃，运行时间为70min；

9)收集样品的指纹电泳图谱，对扩增片段长度为310-380bp的片断进行Kruskal Wallis Test检验。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中所述细菌的种类选自Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述细菌种类和对应的扩增片段长度为：

8.一种LH-PCR细菌基因指纹图谱，其中所述细菌为阴道内细菌，所述基因为16S rRNA基因，所述图谱为对扩增片段长度310-380bp的基因片断的LH-PCR特征峰进行Kruskal Wallis Test检验。

9.一种权利要求1-7的制备方法所制备的LH-PCR细菌基因指纹图谱在判断样品中是否存在细菌性阴道病致病菌群中的用途。

10.一种权利要求8的LH-PCR细菌基因指纹图谱在判断样品中是否存在细菌性阴道病致病菌群中的用途。