一种快速判定丝聚蛋白基因c.3321delA突变的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速判定丝聚蛋白基因c.3321delA突变的方法。
背景技术：
：丝聚蛋白基因（Filaggringene,FLG）的失功能突变使表皮丝聚蛋白含量减少或缺失，进而引起表皮屏障功能发生改变，与鱼鳞病、特应性皮炎（atopicdermatitis,AD）等疾病的发生密切相关。其中，FLG突变c.3321delA是亚洲特异的突变位点，在中国AD患者中最常见。然而，FLG的外显子3由10~12个不等的重复序列组成，这导致其突变位点的检测较为困难。目前，虽然多种方法，如DNA测序、限制性片段长度多态性及重叠聚合酶链式反应已被用于检测c.3321delA突变。然而，一种经济、便捷、高效的用于检测该突变位点的方法尚未见报道。技术实现要素：本发明的目的在于为了克服需要检测FLGc.3321delA突变时的高成本及繁杂的工作量，提供一种低成本、简单、快速判定FLGc.3321delA突变的方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：合成FLG突变c.3321delA的纯合野生型（SEQIDNO:1）及纯合突变型（SEQIDNO:2）标准品，然后将二者按1:1的比例混成杂合型标准品。设计针对c.3321delA突变位点的无标记探针（SEQIDNO:3）,采用高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelting,HRM）-非标记探针法检测c.3321delA突变。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明使得PCR反应结束后便可进行熔解曲线反应，不需进行样本的分离纯化。经过HRM分析处理后的PCR扩增产物还可以直接进行DNA测序，十分方便快捷。此外，HRM技术还具有极高的特异性和理想的灵敏度，因而具有检测时间短，成本低，高通量等特点。附图说明图1为FLG突变c.3321delA野生型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线；图2为FLG突变c.3321delA野生型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图；图3为FLG突变c.3321delA野生型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图2；图4为FLG突变c.3321delA突变型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线；图5为FLG突变c.3321delA突变型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图；图6为FLG突变c.3321delA突变型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图2；图7为FLG突变c.3321delA杂合型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线；图8为FLG突变c.3321delA杂合型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图；图9为FLG突变c.3321delA杂合型标准品HRM-非标记探针法熔解曲线导数图2。具体实施方式1.合成FLG突变c.3321delA野生型及突变型标准品，然后将二者按1:1的比例混成杂合型标准品。2.提取外周血基因组DNA。3.如下表所示，在冰上操作，混合各个配方。成分体积/反应ddH2OVariable10×TrueStartHotStartTaqbuffer（-MgCl2）2µlMgCl22µl10mMdNTPMix0.4µl0.1×Forwardprimer（SEQIDNO:4）1.6µl1×Reverseprimer（SEQIDNO:5）0.8µl1×UnlabelledC3-blockedprobe0.8µlTemplateDNAVariableTrueStartHotStartTaqDNAPolymerase0.2µlTotal20µl4.按照以下循环参数进行PCR：预变性95℃3min；95℃10s，68℃20s，50个循环；72℃5min；4℃forever。5.取步骤4中的PCR产物7µl，加入1µl的饱和荧光染料LCGreenPlus在熔解设备上进行反应。反应条件：95℃30s，40℃1min，1个循环；最后60～95℃，温度以0.3℃/s的速率上升，最终完成熔解曲线分析。6.每次实验均设置阴性对照和阳性对照（野生型、突变型及杂合型标准品，图1-9）。待测样品应用上述方法检测后，将PCR产物直接进行DNA测序，发现两种方法的分型结果完全一致，故此方法完全可以用于判定FLGc.3321delA突变。申请人：深圳北京大学香港科技大学医学中心发明名称：一种快速判定丝聚蛋白基因c.3321delA突变的方法SEQIDNO.1名称：丝聚蛋白基因突变c.3321delA野生型序列：GATTCGAATGGTGTCCTGACCCTCTTGGGACGCTGAGTGCCTGGAGCTGTCTCGTGCCTGCTCGTGGTGGGATCCTTGTCTTCGTCCAGTGCTGGTCCTGGTCCGCCCATGGGCAGACTCAGACTGTTCATGAGTGCTCACCTGGTAGATGAAAGACCCTGAACGTCCAGACCTTCCCCCTGACCAGTCACGTGCGGACTCTTGGTGGCTCTGCTGATGGGGCCCATCCTGTCCATGGCCTGACACTGACTGTGTGTCTGACTCCTCTGAATGTCCCTCACTATCACTGGCCTGACTACCACTGGACCCCCAGTGTCCACTGTCTCTGACTGCAGATGAAGCTTGTCTGCGCGGAATGCCTGAGTGTCTGGAGCTGTCTGCTGACTGCTGGTGGCGGGATCCGTGTCTTTCTCCTGGACTTGATCTTGCCTGTTCATGGGATGACGCAGCCTGTCCACCAGAGGAAGTCTCTGCGTGAGGAGTTCCTGAATCGTCGAACGGCAGGCGTGCAAACTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAASEQIDNO.2名称：丝聚蛋白基因突变c.3321delA突变型序列：CAGACAATCAGGAACTCCTCACGCAGAGACTTCCTCTGGTGGACAGGCTGCGTCATCCCATGAACAGGCAAGATCAAGTCCAGGAGAAAGACACGGATCCCGCCACCAGCAGTCAGCAGACAGCTCCAGACACTCAGGCATTCCGCGCAGACAAGCTTCATCTGCAGTCAGAGACAGTGGACACTGGGGGTCCAGTGGTAGTCAGGCCAGTGATAGTGAGGGACATTCAGAGGAGTCAGACACACAGTCAGTGTCAGGCCATGGACAGGATGGGCCCCATCAGCAGAGCCACCAAGAGTCCGCACGTGACTGGTCGGGGGAAGGTCTGGACGTTCAGGGTCTTTCATCTACCAGGTGAGCACTCATGAACAGTCTGAGTCTGCCCATGGGCGGACCAGGACCAGCACTGGACGAAGACAAGGATCCCACCACGAGCAGGCACGAGACAGCTCCAGGCACTCAGCGTCCCAAGAGGGTCAGGACACCATTCGAATCGTCGAACGGCAGGCGTGCAAACTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGGCTCCSEQIDNO.3名称：UnlabelledC3-blockedprobe序列：TCCAGACCTTCCCCCTGACCAGTCACGTTTTSEQIDNO.4名称：Forwardprimer序列：GAGTGCTCACCTGGTAGATSEQIDNO.5名称：Reverseprimer序列：TCAGGCCATGGACAGGA当前第1页1 2 3