一种葛仙米蛋白质的提取方法与流程

本发明涉及一种葛仙米蛋白质的提取方法。

背景技术：

葛仙米(Nostoc sphaeroids Kutzing)，学名拟球状念珠藻，属蓝藻门(Nostocaceae)念珠藻属(Nostoc.)，与发菜同属，古称天仙米、天仙菜，又名水木耳、田木耳、地木耳(Nostoc commune vauch)，是我国传统出口的珍贵药食两用固氮蓝藻。它是一种多细胞的丝状植物，其细胞结构简单、个体由圆球形细胞组成不分枝的单列丝状体，丝状体呈念珠状，群体呈胶质状、球状或其他不规则形状，蓝绿色或黄褐色，肉眼可见，具有固氮能力。《本草纲目》、《药性考》、《全国中草药汇编》等称葛仙米的功效为明目益气、令人有子、解热清隔、利肠胃、痰火能疗、久食延年、消除疲劳、收敛、治夜盲症、烫火伤等功效。

葛仙米蛋白质含量丰富，可分为两大类，简单蛋白和复杂蛋白。简单蛋白主要组成为清蛋白(主要为藻胆蛋白)、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱溶蛋白，复杂蛋白为复合蛋白。其中，简单蛋白占葛仙米蛋白质50％以上。藻胆蛋白是广泛存在于与红藻、蓝绿藻和隐藻的藻胆体(Phycobilisomes，PBS)中的捕光色素蛋白，包括藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、藻红蛋白(Phycoerythrim，PE)、藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和别藻胆蛋白(Allphycocyanin，APC)四类。研究表明，葛仙米蛋白质、多糖及氨基酸的含量极高，且组成合理，配比均衡，必须氨基酸种类多达16种以上。其中，蛋白质含量为30.8g/100g，氨基酸总含量为31.06g/100g，甚至超过FAO的标准。葛仙米蛋白包含种类齐全，含量丰富，优于其他藻类。因此，葛仙米是很好的蛋白质提取源。

目前，葛仙米蛋白质的提取主要限于藻胆蛋白的提取，而对于葛仙米总蛋白的提取鲜有报道，藻胆蛋白的提取方法主要有反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、超声波法、组织捣碎法，这些方法虽可以提取出葛仙米藻胆蛋白，但是或是方法复杂、条件苛刻，需要-20℃条件下反复冷冻，消耗大量的人力物力财力；或是提取得率低，最高仅为7％；或是引入了难以除去的化学试剂，难以保证产品的纯度。另外，多数文献中均是对藻胆蛋白或其单一成分进行提取分离，如藻红蛋白、藻蓝蛋白的提取，并没有考虑到富含多种成分的葛仙米蛋白质正是一种很好的营养佳品，有着广阔的开发前景。因此，有必要开发一种高效提取葛仙米多种蛋白质的方法应用于工业化生产及应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效提取葛仙米蛋白质的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种葛仙米蛋白质的提取方法，包括以下步骤：

1)将干燥的葛仙米粉碎至10～200目，加入葛仙米粉50～70倍重量的水，提取3次，每次提取4～8h，每隔1h用400W～900W的超声波超声处理10～30min；离心，过滤，得到葛仙米藻胆蛋白粗提取液；滤渣备用；

2)将步骤1)所得葛仙米滤渣加入60～90倍重量的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1mol/L～0.3mol/L，提取3次，每次提取3～7h，每隔1h用400W～900W的超声波超声10～30min，离心，过滤，得到葛仙米碱溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

3)将步骤2)所得葛仙米滤渣加入50～70倍重量的乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为75％～100％，提取3次，每次提取0～6h，每隔1h用400W～900W的超声波超声10～30min，离心，过滤，得到葛仙米醇溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

4)将步骤3)所得葛仙米滤渣加入50～90倍重量的NaCl溶液，所述NaCl溶液的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，提取3次，每次提取0～6h，每隔1h用400W～900W的超声波超声10～30min，离心，过滤，得到葛仙米盐溶蛋白粗提取液，舍弃滤渣；

5)将所得葛仙米藻胆蛋白粗提取液、葛仙米碱溶蛋白粗提液、葛仙米醇溶蛋白粗提液及葛仙米盐溶蛋白粗提液混合，用截留孔径5000～300000D的陶瓷膜超滤两次除杂，用截留孔径5,000D～10,000D的有机膜超滤浓缩，冷冻干燥，即得葛仙米蛋白质。

上述葛仙米蛋白质的提取方法，步骤1)中：

优选地，所述干燥的葛仙米含水量为11～15％，进一步优选为14.6％。

优选地，所述葛仙米粒径为80～200目，进一步优选为120～200目。

优选地，所述葛仙米与水的重量比为1:60。

优选地，采用纯化水。

优选地，所述每次提取时间为6h。

优选地，所述提取温度为室温到45℃，室温一般为20～25℃。

优选地，所述超声波功率为500～800W，进一步优选为700W。

优选地，所述超声时间为20min。

具体地，上述步骤1)包括将干燥的葛仙米(含水量约14.6％)粉碎至120～200目，加入50～70倍重量的纯化水，室温到45℃下提取6h，每隔1h用700W的超声波超声20min，提取3次，离心，过滤。滤渣备用。

上述葛仙米蛋白质的提取方法，步骤2)中：

优选地，所述葛仙米与氢氧化钠溶液的重量比为1:80。

优选地，所述NaOH溶液的浓度为0.2mol/L。

优选地，所述每次提取时间为5h。

优选地，所述提取温度为室温到45℃，室温一般为20～25℃。

优选地，所述超声波功率为500～800W，进一步优选为700W。

优选地，所述超声时间为20min。

具体地，上述步骤2)包括将步骤1)的葛仙米滤渣加入70～90倍重量的0.2mol/L NaOH溶液，45℃条件下提取5h，每隔1h用700W的超声波超声20min，提取3次，离心，过滤。

上述葛仙米蛋白质的提取方法，步骤3)中

优选地，所述葛仙米与乙醇溶液的重量比为1:60。

优选地，所述乙醇溶液的浓度为95％。

优选地，所述每次提取时间为3h。

优选地，所述提取温度为室温到45℃，室温一般为20～25℃。

优选地，所述超声波功率为500～800W，进一步优选为700W。

优选地，所述超声时间为20min。

具体地，上述步骤3)包括将步骤2)的葛仙米滤渣加入50～70倍重量的95％乙醇溶液，45℃条件下提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，提取3次，离心，过滤。滤渣备用。

上述葛仙米蛋白质的提取方法，步骤4)中

优选地，所述葛仙米滤渣与NaCl溶液的重量比为1:70。

优选地，所述NaCl溶液的浓度为0.3mol/L。

优选地，所述每次提取时间为3h。

优选地，所述提取温度为室温到45℃，室温一般为20～25℃。

优选地，所述超声波功率为500～800W，进一步优选为700W。

优选地，所述超声时间为20min。

具体地，上述步骤4)包括将步骤3)中的葛仙米滤渣加入50～90倍重量的0.3mol/L NaCl溶液，45℃条件下提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，提取3次，离心，过滤。滤渣备用。

上述葛仙米蛋白质的提取方法，步骤5)中

优选地，将以上四种蛋白粗提液混合，用截留孔径150，000D～450,000D陶瓷膜进行第一次超滤，直到桶内液体变得粘稠且蓝紫色不明显后停止超滤，取滤出液；将滤出液用截留孔径5,000D～15,000D陶瓷膜进行第二次超滤，不断向超滤桶内补充纯水，4h后取桶内液体，用截留孔径5,000D～10,000D板式有机膜浓缩4-5倍后，将滤出液冻干，即得葛仙米蛋白质提取物。

优选地，所述第一次超滤用陶瓷膜孔径为300,000D。

优选地，所述第二次超滤用陶瓷膜孔径为5,000D。

优选地，所述有机膜孔径为8,000D。

更具体地，上述葛仙米蛋白质的提取方法，包括以下步骤：

1)将干燥的葛仙米粉碎至120～200目，加入葛仙米60倍重量的水，提取3次，每次提取6h，每隔1h用700W的超声波超声处理20min；离心，过滤，得到葛仙米藻胆蛋白粗提取液；滤渣备用；

2)将步骤1)所得葛仙米滤渣加入80倍重量的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2mol/L，提取3次，每次提取5h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米碱溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

3)将步骤2)所得葛仙米滤渣加入60倍重量的乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为95％，提取3次，每次提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米醇溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

4)将步骤3)所得葛仙米滤渣加入70倍重量的NaCl溶液，所述NaCl溶液的浓度为0.3mol/L，提取3次，每次提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米盐溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

5)将所得葛仙米藻胆蛋白粗提取液、葛仙米盐溶蛋白粗提液、葛仙米醇溶蛋白粗提液及葛仙米碱溶蛋白粗提液混合，依次用截留孔径300,000D和5,000D的陶瓷膜超滤两次除杂，用截留孔径8,000D的有机膜超滤浓缩，冷冻干燥，即得葛仙米蛋白质。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)采用超声波辅助提取法与溶胀法结合，相比现有的反复冻融法，大大简化了操作难度，克服了苛刻的条件，同时提取率远优于现有技术，可以将葛仙米中约70％的蛋白质提取出来。

2)采用陶瓷膜超滤的方法除去粗提液中溶出的葛仙米多糖、NaCl、NaOH、乙醇、色素等其他杂质，提纯葛仙米蛋白质，相比硫酸铵多级沉淀法、渗析法等方法提纯，该方法采用物理方法，条件温和，无相变、能耗低，无须引入无机盐离子，操作简便、耗时短、易于储存和规模化生产；

3)采用干燥的葛仙米粉作为原材料提取，工业上易于实现和储存，避免葛仙米鲜品长时间储存易于变质等问题；

4)采用冷冻干燥法得到的蛋白质干品相较于蛋白质在渗析液中保存更易于实际保存，为工业上应用葛仙米蛋白质提供了方便快捷、易于保存的方法；

5)相较于现有技术单一提取藻红蛋白、藻蓝蛋白或者成分较多藻胆蛋白，本方法提取的是全面的葛仙米蛋白质，包括藻胆蛋白(含藻蓝蛋白、藻红蛋白、藻红蓝蛋白和别藻胆蛋白)、盐溶蛋白、醇溶蛋白及碱溶蛋白，该产品可以作为一种全面的营养素添加到工业食品、药品及化妆护肤品中，有着广阔的应用前景；

6)本方法采用室温到45℃提取，提取温度范围广，也避免低温操作，工业上易于实现。

附图说明

图1表示实验例1葛仙米粉粒径数对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图2表示实验例2超声时间对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图3表示实验例3超声波功率对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图4表示实验例4处理方法对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图5表示实验例5料液比对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图6表示实验例6提取时间对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图7表示实验例7提取次数对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图8表示实验例8提取温度对葛仙米藻胆蛋白提取率的影响；

图9表示实验例9碱浓度对葛仙米碱溶蛋白提取率的影响；

图10表示实验例10料液比对葛仙米碱溶蛋白提取率的影响；

图11表示实验例11提取时间对葛仙米碱溶蛋白提取率的影响；

图12表示实验例12醇浓度对葛仙米醇溶蛋白提取率的影响；

图13表示实验例13料液比对葛仙米醇溶蛋白提取率的影响；

图14表示实验例14提取时间对葛仙米醇溶蛋白提取率的影响；

图15表示实验例15盐浓度对葛仙米盐溶蛋白提取率的影响；

图16表示实验例16料液比对葛仙米盐溶蛋白提取率的影响；

图17表示实验例17提取时间对葛仙米盐溶蛋白提取率的影响。

具体实施方式

以下实施例及实验例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过正常渠道商购买得到的常规产品。

以下藻胆蛋白含量检测方法为考马斯亮蓝G250染色法，测定波长为595nm处的吸光值，按李合生的《植物生理生化实验原理和技术》记载方法计算含量。

以下所述提取率的计算方法：

提取率％＝测得的0.1mL蛋白质含量×提取液体积(mL)×10/葛仙米样品中蛋白质的总含量×100％。

本发明最佳实施方式如下，其他实施方式可根据实际情况对相关参数进行调整(具体参见发明内容及以下实验例)，均可实现本发明。

一种葛仙米蛋白质的提取方法，包括以下步骤：

1)将干燥的葛仙米粉碎至120～200目，加入葛仙米60倍重量的水，提取3次，每次提取6h，每隔1h用700W的超声波超声处理20min；离心，过滤，得到葛仙米藻胆蛋白粗提取液；滤渣备用；

2)将步骤1)所得葛仙米滤渣加入80倍重量的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.2mol/L，提取3次，每次提取5h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米碱溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

3)将步骤2)所得葛仙米滤渣加入60倍重量的乙醇溶液，所述乙醇溶液的浓度为95％，提取3次，每次提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米醇溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

4)将步骤3)所得葛仙米滤渣加入70倍重量的NaCl溶液，所述NaCl溶液的浓度为0.3mol/L，提取3次，每次提取3h，每隔1h用700W的超声波超声20min，离心，过滤，得到葛仙米盐溶蛋白粗提取液；滤渣备用；

5)将所得葛仙米藻胆蛋白粗提取液、葛仙米盐溶蛋白粗提液、葛仙米醇溶蛋白粗提液及葛仙米碱溶蛋白粗提液混合，依次用截留孔径300,000D和5,000D的陶瓷膜超滤两次除杂，用截留孔径8,000D的有机膜超滤浓缩，冷冻干燥，即得葛仙米蛋白质。

实验例1实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至10～200目以上，过筛网，得到粒经数分别为10～24目，24～65目，65～80目，80～120目，120～200目和200目以上，分别取0.5g，加入25mL纯化水，30℃提取6h后，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表1和图1，由图1可知，最佳葛仙米粉粒经数为120目～200目。

表1

实验例2实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入25mL纯化水，将葛仙米粉加水后超声30min溶解，提取1h后超声，超声时间为10min、20min、30min、40min、50min及60min，超声后4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表2和图2，由图2可知，随着超声时间的延长，葛仙米藻胆蛋白提取率基本持平，综合考虑，最佳超声时间为20min。

表2

实验例3实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入25mL纯化水，提取1h后超声20min，超声功率为400W、500W、600W、700W、800W及900W，超声后4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表3和图3，由图3可知，最佳的超声波功率为700W。

表3

实验例4实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至10～200目以上，过筛网，得到粒经数分别为10～24目，24～65目，65～80目，80～120目，120～200目和200目以上。对葛仙米粉进行不同的处理方式，设为三组，第一组为直接水提组，将该组的样品取0.5g直接加入25mL纯水，搅拌溶解，室温提取21h；第二组为超声波辅助提取组，将该组的样品0.5g加入25mL纯水，700W功率超声20min溶解，室温提取，每隔1h后超声一次，提取21h；第三组为冻融组，将该组的样品0.5g加入纯水25mL，复水20h，放置冰箱-20℃冷冻室冷藏21h，取出，室温解冻5h。4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表4和图4，由图4可知，最佳处理方法为超声波辅助提取法。

表4

实验例5实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目分别取0.5g，加入15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，30℃提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表5和图5，由图5可知，最佳葛仙米粉和纯水的料液比为1:60。

表5

实验例6实验室小试提取藻胆蛋白将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，30℃提取，0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h及6h后测蛋白质含量。结果见下表6和图6，由图6可知，随着提取时间的延长，葛仙米藻胆蛋白提取率逐渐增高，开始增长速率很快，随后渐渐平缓，在6h已达到24.15％，综合考虑，最佳藻胆蛋白的提取时间为6h。

表6

实验例7实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至10～200目以上，过筛网，得到粒经数分别为10～24目，24～65目，65～80目，80～120目，120～200目和200目以上。分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，30℃提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。提取1次、2次3次。结果见下表7和图7，由图7可知，超过3次的提取对藻胆蛋白的提取率并无明显效果，因此，最佳提取次数为3次。

表7

实验例8实验室小试提取藻胆蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，15℃、30℃、45℃及60℃提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表8和图8，由图8可知，最佳提取温度为45℃，室温时提取率也达到20％以上。

表8

实验例9实验室小试提取碱溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入30mL NaOH溶液，浓度分别为0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L，45℃下超声波辅助提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表9和图9，由图9可知，最佳碱浓度为0.2mol/L。

表9

实验例10实验室小试提取碱溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，45℃下超声波辅助提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表10和图10，由图10可知，葛仙米粉和碱溶液的最佳料液比为1:80。

表10

实验例11实验室小试提取碱溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，45℃下超声波辅助提取0h、1h、2h、3h、4h、5h及6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表11和图11，由图11可知，碱溶蛋白的最佳提取时间为5h。

表11

实验例12实验室小试提取醇溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入45％、55％、65％、75％、85％及95％醇溶液30mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表12和图12，由图12可知，最佳醇浓度为95％。

表12

实验例13实验室小试提取醇溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加95％醇溶液15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表13和图13，由图13可知，最佳葛仙米粉和醇溶液的料液比为1:60。

表13

实验例14实验室小试提取醇溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加95％醇溶液30mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取0h、1h、2h、3h、4h、5h及6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表14和图14，由图14可知，醇溶蛋白的最佳提取时间为3h。

表14

实验例15实验室小试提取盐溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加95％醇溶液30mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取3h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入30mL NaCl溶液，浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L及0.6mol/L，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表15和图15，由图15可知，最佳盐浓度为0.3mol/L。

表15

实验例16实验室小试提取盐溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加95％醇溶液30mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取3h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.3mol/L NaCl溶液15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表16和图16，由图16可知，葛仙米粉和盐溶液的最佳料液比为1:70。

表16

实验例17实验室小试提取盐溶蛋白

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，加入30mL纯化水，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取6h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加入0.2mol/L NaOH溶液40mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取5h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加95％醇溶液30mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取3h，4000r/min离心10min，过滤。将滤渣加0.3mol/L NaCl溶液35mL，每隔1h 700W超声20min，45℃下提取0h、1h、2h、3h、4h、5h及6h，4000r/min离心10min，过滤，得到粗提液。结果见下表17和图17，由图17可知，盐溶蛋白的最佳提取时间为3h。

表17

实验例18不同提取方法对葛仙米总蛋白含量的影响

将经过晒干或者烘干的葛仙米干品(含水量14.6％)用万能粉碎机粉碎至120～200目，分别取0.5g，分成6组，每组按照不同的顺序提取不同的蛋白质，第一步提取藻胆蛋白，第二至四步分别按不同顺序提取盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。

实验条件：藻胆蛋白提取：纯水提取、料液比1:60、提取时间6h、提取温度45℃、每隔1h 700W超声20min；盐溶蛋白提取：NaCl浓度0.3mol/L、料液比1:70、提取时间3h、提取温度45℃、每隔1h 700W超声20min；碱溶蛋白提取：NaOH浓度0.2mol/L、料液比1:80、提取时间5h、提取温度45℃、每隔1h 700W超声20min；醇溶蛋白提取：乙醇浓度95％、料液比1:70、提取时间3h、提取温度45℃、每隔1h 700W超声20min。结果见下表18。

表18

由表18可知，提取顺序为第一步提取藻胆蛋白、第二步提取碱溶蛋白、第三步提取醇溶蛋白、第四步提取盐溶蛋白的总提取率最高，显著高于其他各组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。