一种改造芽孢杆菌基因组的方法与流程

文档序号:12412120阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:包括以下步骤:

(1)在pBAV1K-T5-GFP质粒的EcoR I和Apa I位点插入多克隆位点片段,并且通过同义突变,删除其中的NdeI酶切位点,得质粒pBTS;

(2)在多克隆位点的左端的酶切位点插入500-800bp的同源重组片段A,右侧酶切位点插入500-800bp的同源重组片段B,中间插入突变片段、目的片段或不插入任何片段,既两个同源重组区域之间需要改造的片段,得质粒pBTS-X;

(3)通过电转化将pBTS-X转入芽孢杆菌中,得阳性转化菌株;

(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养,培养温度为45℃,培养时间大于24h;

(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul,涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上,培养温度为45℃,进行过夜培养;

(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养,每8—16h传代一次,直到筛选到无抗菌株;

(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板,稀释105-106倍,过夜培养;

(8)挑取步骤(7)中的菌落进行抗性鉴定,直到获得5-10株无抗菌株;

(9)将无抗菌株接种到液体培养基中,过夜培养,抽提细菌基因组,进行PCR鉴定;阳性菌株继续进行测序鉴定,测序鉴定结果为阳性菌株即得芽孢杆菌菌株。

2.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:所述步骤(3)中芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、Z12菌株、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它pBTS质粒具有温度敏感复制特性的革兰氏阳性菌。

3.根据权利要求2所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:所述革兰氏阳性菌为肺炎链球菌、乳酸乳球菌或类芽孢杆菌菌株。

4.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:所述pBTS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)在pBTS的多克隆位点左侧端插入400-800bp的同源重组片段A,右侧端插入400-800bp的同源重组片段B,中间插入突变片段或目的片段或不插入片段,再在B与中间的改造片段或者A与中间的改造片段之间插入具有H霉素抗性片段,H霉素抗性片段两端含有cre重组酶识别的lox71和lox72片段,该质粒命名为pBTS-X-Z;

(2)通过电转化将pBTS-X-Z质粒转化进入芽孢杆菌中,得阳性转化菌株;

(3)挑取步骤(2)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养,培养温度为45℃,培养时间大于24h;

(4)取步骤中(3)中菌液100ul—500ul,涂布到含有卡那霉素或H霉素的平板上,培养温度45℃,过夜培养;

(5)挑取(4)中的菌落进入含有H霉素抗性的液体LB培养基中进行培养,每8—16h传代一次,直到筛选到只具有H霉素抗性的菌落;

(6)取(5)中的菌液进行稀释涂板,平板含有H霉素抗性,稀释105-106倍,过夜培养;

(7)挑取(6)中的菌落进行抗性鉴定,直到获得5-10株只具有H霉素抗性,不具有卡那霉素抗性的菌株;

(8)取单抗菌株接种到液体培养基中,过夜培养,抽提细菌基因组,进行PCR鉴定,阳性菌株继续进行测序鉴定,测序鉴定为阳性的菌株进入下一步;

(9)转化pBTS-IC质粒进入(8)中鉴定为阳性的单抗菌株,IC为乳糖操作子调控cre重组酶表达的片段,cre重组酶可特性识别lox71和lox66位点,进行重组,在基因组中留下不能被cre重组酶识别的loxP位点,切割下片段含有更容易识别的lox72位点;

(10)挑取(9)中的阳性转化菌株,接菌进行培养,利用IPTG诱导表达或者渗漏表达的cre重组酶切割H霉素抗性片段;

(11)取(10)中的菌液,接种到液体培养基中,培养温度为45℃,培养时间大于24h;

(12)取(11)中培养的菌液,稀释105-106涂板到无抗的平板上,培养温度为45℃,过夜培养;

(13)取(12)中的单菌落,进行抗性鉴定,直到筛选到2-5株无抗菌株;

(14)取(13)中的无抗菌株,接种到培养基中,过夜培养,抽提基因组,进行PCR鉴定,阳性菌株再进行测序鉴定,仍然鉴定为阳性的菌株即为完成基因组改造的菌株。

6.根据权利要求5所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:所述H霉素为博来霉素、四环素、氯霉素和壮观霉素中的任一一种。

7.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法,其特征在于:所述pBTS-IC核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

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