生物可降解超分子聚乳酸微球的制备方法与流程

本发明涉及生物可降解高分子领域，特别涉及一种生物可降解超分子聚乳酸微球的制备方法。

背景技术：

纳米颗粒或微球作为一种药物载体材料，在药物的控制释放领域得到了广泛的研究和应用。微球载体能够克服现有药物制剂的一些弊端，利用自身的微小粒径和药物的高度分散，改善难溶性药物的水溶性和溶出速率，提高药物的生物利用率。

制备聚合物微纳米颗粒或微球的传统方法有喷雾干燥、乳液溶剂挥发和凝聚的方法，这些方法存在明显的不足之处，例如有毒溶剂或助剂的使用难以从微球中完全去除，影响微球的生物相容性，难以调控微球的尺寸和尺寸分布等。为了克服传统方法的不足，文献上已报导采用沉淀和溶剂挥发的方法来制备生物可降解的聚合物微纳米微球。据文献(Chen X等，Biomacromolecules 2005,6,2843-2850)报导，将立构多嵌段的聚乳酸(PLA)溶解在良溶剂中，然后再在非溶剂中置换，制备了花型和圆盘形的聚合物颗粒，颗粒的粒径分布较均匀，在几十纳米到几微米之间。论文(Zhou Z等，Macromol.Mater.Eng.2016,301,274-278)通过改变溶剂的类型、聚合物溶液的浓度和干燥方法，制备了花瓣形的PLA纳米片，该方法可很好调控材料的孔隙率和机械性能。

PLA可基于生物质资源制备，具有许多优异的性能，比如生物可降解性、生物相容性和环境友好性。由于PLA的单体具有旋光异构性，故PLA有两种对映异构体，即聚左旋乳酸(PLLA)和聚右旋乳酸(PDLA)，其中PLLA更为常见。PLLA的熔点为170℃，结晶速率较慢。当PLLA和PDLA共混时，可形成立构复合结晶，熔点高达230℃，比单独的PLLA或PDLA的同质结晶高约50℃。此外，对PLA末端官能化能调控聚合物的结晶，从而改善聚合物的热性能和形貌。论文(Biela T等，Macromolecules 2015,48,2994-3004)在PLA的末端用2-脲基-4[1H]-嘧啶酮(UPy)或尿嘧啶修饰，将PLLA和PDLA等比例共混，用N-甲基吡咯烷酮溶解，甲醇沉淀，制备了球形颗粒。当利用UPy双端修饰时，用三氯甲烷溶解，甲醇沉淀，得到纤维状的形貌结构。因此，将PLA的立构复合结晶和端基修饰结合，可以得到不同结构和性能的微纳米材料。

但是，大多数传统沉淀和溶剂挥发的方法只能得到球形颗粒。在制备载药微球时，传统制备方法需要加入乳化剂。论文(Teng等，J.Appl.Polym.Sci.2015,132,42213-42219)在制备装载利福平药物的星型聚乳酸微球时，加入了2.5％的聚乙烯醇作为乳化剂，最终通过沉淀和洗涤的方法移除聚乙烯醇乳化剂。论文(Zhang等，Polym.Bull.2012,68,27-36)在制备牛血清蛋白装载的星型聚(乙交酯-co-丙交酯)无规共聚物微球时，也用聚乙烯醇作为乳化剂。但是乳化剂的使用使得难以从微球中完全去除，从而限制了生物可降解颗粒的广泛应用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种生物可降解超分子聚乳酸微球的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种生物可降解超分子聚乳酸微球的制备方法，是将2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修饰的聚乳酸溶解于良溶剂中，在搅拌条件下逐滴加入不良溶剂；持续搅拌24小时后，离心洗涤、收集固体沉淀；真空干燥后，得到生物可降解超分子聚乳酸微球；所述良溶剂是二氯甲烷、氯仿或四氢呋喃中的任意一种；不良溶剂是乙醇或甲醇。

本发明中，将2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修饰的聚乳酸溶解于良溶剂中时，使聚乳酸溶液的浓度为1mg/mL。

本发明中，所述不良溶剂在溶剂总用量中所占的体积分数为20％～90％。

本发明中，所述干燥是指在60℃下干燥6h。

本发明中，所述2-脲基-4-[1H]-嘧啶酮(UPy)端基修饰的聚乳酸的分子形式呈线性或三臂星形，其具体结构式为：

线性聚乳酸：

三臂星形聚乳酸：

上述式中，

其中，n为40～890。

本发明中，所述聚乳酸的分子量在3～64kDa之间，是聚左旋乳酸、聚右旋乳酸或者两者的混合物。

发明原理描述：

在溶剂置换中，结晶可以诱导不同微纳米组装结构的形成，微纳米组装体的结构与成核形式、结晶速率、结晶结构有关。PLA有两种结晶形式，两种结晶的比例可通过混合比例调控，所以可利用两种结晶形式不同的成核速率、结晶增长速率、链堆积形式制备不同形貌的生物可降解颗粒。另外，当链段中引入可形成非共价键的超分子基团时，可增加链间相互作用力和链缠结程度，从而改变溶液结晶中自组装颗粒的大小和形貌。

本发明通过沉淀和溶剂挥发的方法制备PLA微球，在溶剂置换的过程中，通过液液相分离和聚合物结晶相结合的方式，可以得到不同形貌的聚乳酸微球，而且，通过控制不同立体异构聚乳酸的共混，可以实现不同形貌的微球之间的转变，显著区别于传统沉淀和溶剂挥发制备方法所能得到的球形颗粒。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所述的PLA微球采用沉淀和溶剂挥发的方法制备，简单易行，可实施性高。

(2)本发明利用液液相分离和聚合物结晶相结合的方法来调控聚合物微球的形貌，同时调控其结构与性能，扩大应用范围。

(3)本发明采用UPy的四重氢键来构筑超分子聚合物，四重氢键作用力强，调控不同链拓扑结构PLA的链缠结程度，从而得到不同形貌的PLA微球。

(3)本发明所制备的材料的原料均来自生物质可再生资源，使用后可完全降解，绿色环保，同时具有良好的生物相容性。

(4)本发明采用药物和聚合物共沉淀的方法制备载药颗粒，可以有效的避免乳化剂使用，从而使得聚合物纳米颗粒或微球具有更为广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例2制备的PLA颗粒的形貌特征。

图2为实施例3制备的PLA颗粒的形貌特征。

图3为实施例8制备的PLA颗粒的形貌特征。

图4为实施例9制备的PLA颗粒的形貌特征。

图5为对比例1制备的PLA颗粒的形貌特征。

图6为对比例2制备的PLA颗粒的形貌特征。

图7为实施例2、3和对比例1超分子PLA颗粒在磷酸缓冲液中的载药释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明制备所使用试剂与药品如下：L-丙交酯和D-丙交酯购自普拉克公司；L-丙交酯和D-丙交酯在乙酸乙酯中重结晶纯化，备用；1,6-己二醇、三羟甲基丙烷和辛酸亚锡购自Sigma-Aldrich公司；1,6-二异氰酸酯购自万华化学公司；2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶和氮甲基吡咯烷酮购自J&K公司。

本发明所述异氰酸根末端官能化的2-脲基-4[1H]嘧啶酮(UPy-NCO)的结构式为：

参照文献(Meijer E W等，Science 1997,278,1601-1604)方法制备，具体步骤如下：将2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶(10.0g)加入至500ml三口烧瓶中，65℃下抽真空0.5h，充氩气保护，加入95.0g六亚甲基二异氰酸酯和3.2g氮甲基吡咯烷酮为催化剂，其中HDI摩尔数为2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶摩尔数的7倍，催化剂含量为总反应物质量的3％。100℃下反应16h后，将产物溶于三氯甲烷中，滴入体积比为6:1的正庚烷与异丙醚的混合液中(共700ml)，沉淀，过滤。将白色固体产物置于50℃真空烘箱中干燥10h，备用。

羟基末端官能化的线性和三臂星形PLLA和PDLA参照文献(Pan P等，Cryst.GrowthDes.2016,16,1502-1511)方法制备，设计分子量为8kg/mol的三端羟基封端的三臂星形PLLA的具体制备步骤如下：将20g L-丙交酯、0.335g三羟甲基丙烷和0.12g辛酸亚锡干燥后加入烧瓶中，氩气保护，在130℃条件下反应5h，得到PLLA产品。将得到的粗产物于三氯甲烷中溶解，在无水乙醚和正己烷等体积混合的沉淀剂中沉淀除去未反应的丙交酯，过滤，干燥得到聚合物。通过改变引发剂与丙交酯的质量比，制备了具有不同分子量的聚合物。聚合物的分子量由核磁共振氢谱测定。本发明所使用双端羟基封端的线性和三端羟基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制备条件与分子量列于表1。表1：双端羟基封端的线性和三端羟基封端的三臂星形PLLA、PDLA的制备条件与分子量

注：聚合物名称中，2L、2D、3L、3D分别代表双端羟基封端的线性PLLA、PDLA及三端羟基封端的三臂星形PLLA、PDLA，后缀数字表示聚合物从核磁所计算的分子量。

1)UPy端官能化PLLA和PDLA的制备

参照(Pan P等，Cryst.Growth Des.2016,16,1502-1511)方法，进一步制备了UPy端基官能化的线性和三臂星形的PLLA和PDLA，具体方法为：将羟基末端官能化的线性或三臂星形PLLA或PDLA、异氰酸根末端官能化的UPy-NCO、辛酸亚锡和甲苯置于希丁克管中，氩气保护下，在110℃反应12小时；反应结束后利用旋转蒸发仪除去有机溶剂，然后加入至二氯甲烷中溶解，过滤。在室温下使溶剂挥发，得到的固体物质即为UPy端官能化的PLLA或PDLA。其中，UPy-NCO的摩尔量是羟基末端官能化的线性或三臂星形PLA的3倍，辛酸亚锡占总质量的0.6％，甲苯质量为PLLA或PDLA质量的30倍。

NMR测试：利用核磁共振(Bruker公司，400MHz)测试聚合物的¹H NMR谱图，进而计算其数均分子量(M_n)。测试温度为室温，溶剂为氘代氯仿，化学位移(δ)由溶剂峰校正。分子量计算说明：对于PLA，通过比较端羟基相邻的叔碳上的氢(δ＝4.3ppm)与主链中叔碳上的氢(δ＝5.1ppm)的峰面积比计算聚合度和分子量。

2)超分子PLA微球的制备

实施例1～9

在实施例1～9中，将UPy端基官能化的线性或三臂星形PLLA、PDLA按一定质量比溶于二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃等良溶剂中，使聚合物溶液的浓度为1mg/mL。搅拌混合2h后，逐滴加入乙醇、甲醇等不良溶剂中，搅拌，不良溶剂所占的体积分数为20％～90％，4h后滴完。然后搅拌24h后，离心洗涤，收集固体沉淀。将固体沉淀60℃下真空干燥6h后，得到生物可降解的超分子PLA微球。

在对比例1和2中，以羟基末端官能化的线性或三臂星形PLLA、PDLA或两者的混合物为原料，利用相同的方法制备PLA颗粒。实施例1～9和对比例1～2中PLLA、PDLA配比、溶剂中不良溶剂所占体积分数列于表2中。

形貌表征：采用场发射扫描电子显微镜(FESEM)表征。将干燥的聚乳酸颗粒粘附在导电碳胶上使用CorlzeisD Utral55型FESEM以5keV加速电压进行观察。

PLA颗粒的载药和药物缓释实验以抗癌药物利福平为例，将10mg的利福平、100mg的UPy端基官能化的PLLA、PDLA混合物共同溶解于二氯甲烷中，聚合物的初始浓度为1mg/mL；2h后，逐滴加入无水乙醇，搅拌；乙醇所占的体积分数为70％，4h后滴完。搅拌24h后，离心、洗涤，干燥后，得到生物可降解的聚乳酸载药颗粒。

取2.5mg的PLA载药颗粒溶于10mL的N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，用紫外-可见光分光光度计测定溶液在340nm波长处的吸光度，基于标准曲线计算颗粒的载药量。

PLA颗粒的酶降解实验：将2.0mg蛋白酶K、1.0mg叠氮化钠和一定量用滤纸包好的PLA颗粒加入至10mL磷酸缓冲溶液(pH＝7.4,50mM)中，然后置于37℃的恒温摇床上使其缓慢降解，一定的时间间隔后，将PLA颗粒冷冻干燥，根据PLA颗粒的重量损失，从而计算降解率。

热性能测试：使用DSC测试，氮气气氛。样品以10℃/min从室温升温至180℃或者230℃。热性能参数的计算方法如下：120℃至160℃间的吸热峰为PLLA、PDLA同质结晶的熔融峰，峰值温度为同质结晶的熔点，积分面积为同质结晶熔融焓(ΔH_m,hc)。180℃至220℃间吸热峰为PLLA/PDLA立体复合结晶的熔融峰，积分面积为立体复合结晶焓(ΔH_m,sc)。立体复合结晶的相对分数(f_SC)由公式f_SC＝ΔH_m,sc/(ΔH_m,sc+ΔH_m,hc)计算得到。

表2为实施例1～9和对比例1～2中PLA颗粒的制备条件、形貌、粒径、载药量、降解率和热性能参数。

表2：实施例1～9和对比例1～2中PLA颗粒的制备条件、形貌、粒径、载药量、降解率和热性能参数

由表2和图1可知，在实施例2中，超分子PLA颗粒为花瓣形形貌。而对比例1中的颗粒形貌不规整，说明超分子基团的存在可促进链缠结，从而形成蓬松的花瓣型结构。实施例4也不能形成花瓣形结构，主要是由于线形PLA的链缠结密度没有三臂星形PLA链缠结密度高。当PLLA和PDLA的共混质量比为50/50时(如实施例3、5和对比例2)，均呈现出球形特征，主要是由于立体复合结晶的形成导致结晶速率加快，链堆积紧密，降低液液微相分离的尺寸，从而形成尺寸较小的球形颗粒。对比实施例1、2、6，改变良溶剂和劣溶剂的类型以及良溶剂所占的体积分数，均能得到花瓣形结构，表明良溶剂和劣溶剂的不同选择不会影响颗粒的形成。

对比实施例3和对比例2，由图1可知，实施例3的球形粒子尺寸较大，表面光滑度降低，主要是UPy超分子端基的存在增大了链缠结，容易形成较大的颗粒。实施例4表现为片状结构，不能形成花瓣形结构。实施例6的形貌特征表明高分子量的PLA也能形成花瓣形结构，但实施例7的结果表明高分子量的PLLA和PDLA等质量共混时，不能形成球形粒子。

由表2可知，实施例8、9中改变了超分子PLLA和PDLA的共混比例，对比实施例2、8、9可知，通过改变超分子PLLA和PDLA的混合比例，可以实现聚合物颗粒从花瓣形到球形形貌的转变。说明立构复合结晶作用的增强，分子链的堆积更为紧密，同时结晶速率加快，更易形成球形颗粒。

PLA颗粒对包裹在颗粒内的药物具有缓释效果。取2mg载药PLA颗粒分散在5mLPBS缓冲溶液(pH＝7.4，50mM)中，待溶液分散均匀，将溶液转移至透析袋中(截留分子量为3500)，对10mL PBS缓冲溶液(pH＝7.4，50mM)进行透析。透析袋外的缓冲溶液经一定的时间间隔进行更换，同时利用紫外分光光度计测试缓冲溶液中的利福平浓度，进而计算累计释放量。图2为实施例2～3和对比例1中PLA载药颗粒的药物释放曲线。由图2可知，对比实施例2、3的结果，随着PLLA和PDLA共混比例趋向于50/50时，立构复合结晶的含量升高，聚合物和药物分子之间的作用增强，链堆积更为紧密，所以PLA颗粒的药物装载量逐渐增大，释放的速率逐渐减慢。同时表3也说明了这一结果，对比实施例2、3、8、9可知，随着PLLA和PDLA共混比例趋向于1/1时，PLA颗粒的药物装载量从0.34％增加至4.11％，降解率从41％降至25％。因此，UPy端基官能化的线性或三臂星形PLA颗粒可用作药物释放的载体，并且通过调控PLA的端基修饰和PLA的结晶形式控制载药颗粒的释放行为。

最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。