本发明属于医药领域,具体涉及一种抗肿瘤活性的特定化学结构的化合物，以及制备该类化合物的方法。
背景技术：
癌症是起源于上皮组织的恶性肿瘤，以细胞的快速增殖和转移为特点的疾病，死亡率居于所有疾病的首位。根据国际癌症研究机构公布的全球最新癌症数据，2012年全球新增1410万例癌症患者，并且还将以11%的年增长速度递增。因此，癌症治疗方面的研究一直被全世界所密切关注。
目前，临床上治疗癌症的方式主要有四种：手术治疗、放射线治疗、化学药物治疗和免疫治疗。与其他三种方法相比，化学药物治疗一般是无痛的，并且对癌细胞的杀伤力是其他治疗癌症的手段所难以达到的。但大多数的化学药物并不具有专一性，在杀死癌细胞的同时，会对肿瘤周围的正常组织细胞造成损伤，这些组织通常只有在化疗后可以自行修复。所以，寻找靶向性强、效果显著、安全性高的抗肿瘤药物已经成为全球医药研发者研究的热点之一。
随着肿瘤分子生物学技术的不断发展，人们对恶性肿瘤发病机制进一步的认识，对多种致癌途径的不断揭示，研制了多种分子靶向治疗药物。分子靶向治疗是针对在肿瘤发生、发展及转移过程中起关键作用的靶分子及其相关信号通路，干扰或阻断其功效，达到抑制肿瘤生长、转移的目的。药物进入体内靶向性地与致癌位点结合，使肿瘤细胞特异性死亡，不会对正常组织细胞带来损伤。目前，已进入临床阶段的药物包括小分子表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)抑制剂、针对某些特定细胞标记的单克隆抗体、抗肿瘤血管生成的药物、多靶点激酶抑制剂(multi-targeted tyrosine kinase inhibitors，TKIs)等。总之，随着分子生物学的发展，癌症治疗已经进入靶向的治疗时代。因此，进一步研发靶向性强、高效、低毒的新型抗癌药物，己成为当今抗肿瘤药物研究的重要方向。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了嘧啶类抗肿瘤化合物及其制备方法，此类化合物属于新型此类化合物属于新型VEGFR-2抑制剂，在体外对VEGFR-2激酶抑制活性实验中表现出良好的抑制活性。
为了实现上述目的，本发明提供的嘧啶类抗肿瘤化合物的结构通式为通式Ⅰ或通式Ⅱ具体如下：
。
其中:酰基肼基团的位置可以是2位、3位或4位；X为氢原子、甲基、氟原子、氯原子或溴原子；芳环上取代基的位置可以是2位、3位或4位取代，取代可以是单取代或多取代。
所述的抗肿瘤化合物的结构通式优选为：
。
其中: X为H、Cl或CH3。
所述的通式为I的化合物的结构选自下述任意一种，但不仅限于以下化合物，只要化合物结构式满足通式，均为本发明的限定范围。
N'-苯基-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-苯基-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-苯基-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼。
所述的抗肿瘤化合物的结构通式优选为：
。
其中: X为H、Cl或CH3。
所述的通式为Ⅱ的化合物的结构选自下述任意一种，但不仅限于以下化合物，只要化合物结构式满足通式Ⅳ，均为本发明的限定范围。
N'-苯基-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-苯基-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-苯基-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(2-甲苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-甲苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
N'-(3-氯苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼。
为了实现上述目的，本发明还提供所述一类制备该抗肿瘤化合物的制备方法。
所述通式Ⅰ和 Ⅱ所示化合物的制备方法，具体包括以下步骤。
步骤1、羧酸尿嘧啶通过卤化反应得到尿嘧啶酰氯。
步骤2、硝基苯甲酸与取代苯肼通过脱水缩合并还原得到氨基苯甲酰芳基肼。
步骤3、将步骤1所得嘧啶酰氯与2步骤所得氨基苯甲酰基芳基肼经酰化反应得到通式Ⅰ和Ⅱ所示化合物。
所述的化合物可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的有益效果。
本发明在设计该化合物时，对小分子抑制剂与VEGFR-2复合物结构中配体-受体相互作用的特点进行分析，提取关键药效团并进行虚拟筛选，设计了一类全新结构类型的VEGFR-2抑制剂。药理研究显示，本发明的化合物对人胃癌BGC-823细胞、人胃癌MGC-803细胞、人白血病K562细胞和人白血病HL60细胞均有一定的抑制活性。
具体实施方式
实施例1。
N'-苯基-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
步骤（1）、N'-苯基-2-硝基-苯甲酰肼的制备：于100ml反应瓶中加入邻硝基苯甲酸(4g，23.94mmol)，1-羟基苯并三唑(3.4g，25.13mmol)，DMF 40ml，0℃条件下，缓慢加入EDCI(4.82g，25.13mmol)，搅拌半小时，移至室温下反应2h，即得活性酯溶液；于另一250ml反应瓶中加入苯肼盐酸盐(25.13mmol)，吡啶(3.98g，50.26ml)，DMF 30ml，室温搅拌30min，于0℃条件下，缓慢加入上述制备的活性酯溶液，反应2h，移至室温下反应6h；反应完毕，将反应液倒入水中，析出粗品，静置30min，抽滤，得滤饼，水洗，40℃干燥过夜，得白色固体4.20g，收率：68.21%。
步骤（2）、N'-苯基-2-氨基-苯甲酰肼的制备：于250ml反应瓶中加入锌粉(4.07g，62.20mmol)，氯化铵(2.5g，46.65mmol)，乙醇90ml，水60ml，少量冰醋酸，50℃下反应30min，活化锌粉；放冷，将反应瓶移至冷井中，温度控制在0℃以下，缓慢加入N'-取代苯基-邻/间/对硝基苯甲酰肼(15.55mmol)，搅拌10min，移至常温下反应4h，反应完毕后，静置半小时；将反应液倒入20%的NaHCO3溶液中，乙酸乙酯萃取，旋干乙酸乙酯得粗品，乙酸乙酯重结晶，得纯品1.20g，收率33.96%。
步骤（3）、尿嘧啶-5-甲酰氯的制备：于100 mL反应瓶中加入脲嘧啶-5-羧酸(2g，12.81mmol)，氯化亚砜(1.73ml，19.22mmol)，甲苯30 mL，两滴 DMF，回流反应24h，冷却，抽滤，即得脲嘧啶-5-甲酰氯，白色粉末2.12g，收率94.80%。
步骤（4）、N'-苯基-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼（A1）的制备：于100ml反应瓶中加入N'-苯基-2-氨基-苯甲酰肼(2.86 mmol)，DMF 20ml，吡啶(0.45 g，5.73 mmol),0℃下缓慢加入脲嘧啶-5-甲酰氯(0.5 g，2.86 mmol)，反应1h，常温下继续反应12h；反应完毕后，将反应液缓慢倒入水中，析出固体，用10%的稀盐酸调节溶液pH值至2-3，抽滤得固体，用饱和Na2CO3溶液洗涤，得白色固体粉末，40℃干燥过夜得目标化合物0.35g ，收率：33.44%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.63 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 8.34 – 8.19 (m, 2H), 7.86 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.18 (dt, J= 15.6, 7.5 Hz, 3H), 6.83 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.72 (t, J = 7.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ167.6, 164.0, 161.9, 152.9, 152.1, 149.6, 137.4, 131.3, 129.1, 128.5, 125.0, 123.7, 123.7, 119.0, 112.7, 103.8。
实施例2 。
N'-(2-甲苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以邻甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲基苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得浅黄色固体，即为目标化合物。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.64 (s, 3H), 10.34 (s, 1H), 8.25 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.23 (dd, J = 16.6, 9.1 Hz, 2H), 7.02 (dd, J = 18.1, 7.5 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.68 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 2.21 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 167.5, 163.6, 161.2, 151.0, 149.3, 146.8, 137.3, 131.5, 130.4, 128.4, 126.8, 124.9, 124.0, 123.8, 122.3, 119.2, 111.4, 104.8, 17.7。
实施例3。
N'-(3-甲苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲基苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得白色固体，即为目标化合物。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.63 (s, 2H), 10.27 (s, 1H), 8.24 (s, 2H), 7.76 (d, J = 40.7 Hz, 2H), 7.51 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.71 – 6.50 (m, 3H), 2.20 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) d 167.5, 163.6, 161.3, 151.2, 149.6, 138.2, 137.3, 131.4, 129.0, 128.4, 124.9, 123.8, 119.9, 113.2, 110.0, 21.7。
实施例4 。
N'-(3-氯苯基)-2-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼制备方法。
以间甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲基苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得白色固体，即为目标化合物。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.59 (s, 3H), 10.34 (s, 1H), 8.23 (dd, J = 20.5, 11.5 Hz, 3H), 7.71 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.24 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.86 – 6.68 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 167.6, 163.7, 161.3, 151.3, 151.1, 149.7, 137.1, 133.9, 131.5, 130.8, 128.4, 125.0, 124.0, 123.9, 118.4, 111.9, 111.3, 104.5。
实施例5。
N'-苯基-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-苯基-3-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得白色固体0.38g，即为目标化合物，收率：36.31%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.89 (s, 2H), 11.07 (s, 1H), 10.39 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.10 (s, 1H), 7.91 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.72 (t, J = 7.3 Hz, 1H)。 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 165.0, 160.9, 150.8, 149.8, 149.3, 138.7, 134.3, 129.6, 129.1, 123.0, 122.8, 119.0, 119.0, 112.7, 104.2。
实施例6 。
N'-(2-甲苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和邻甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲基苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得黄色固体粉末0.42g ，即为目标化合物，收率：38.65%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.10 (s, 1H), 10.43 (dd, J = 18.5, 2.5 Hz, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.12 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 8.1, 1.3 Hz, 1H), 7.82 – 7.73 (m, 1H), 7.66 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.50 (dt, J = 15.9, 7.9 Hz, 1H), 7.29 (t, J = 3.2 Hz, 1H), 7.02 (dd, J = 12.1, 7.4 Hz, 2H), 6.73 – 6.65 (m, 2H), 2.21 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 165.0, 161.0, 151.1, 149.7, 147.1, 138.8, 134.3, 130.4, 129.6, 126.8, 123.0, 122.7, 122.3, 119.1, 119.0, 111.4, 104.1, 17.7。
实施例7 。
N'-(3-甲苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和间甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲基苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得黄色固体粉末0.46g ，即为目标化合物，收率：42.33%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 8.30 (br. s., 1H), 7.98 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.65 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.47 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.03 (t, J=7.6 Hz, 1H), 6.61 (br. s., 1H), 6.54 (d, J=7.3 Hz, 1H), 2.21 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 149.9, 138.2, 134.3, 129.6, 129.0, 128.9, 123.0, 119.9, 119.0, 113.2, 113.2, 113.2, 110.0, 21.7。
实施例8。
N'-(3-氯苯基)-3-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和间氯苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-氯苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.40g ，即为目标化合物，收率：34.93%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.33 (s, 1H), 10.44 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.17 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.75 (dd, J = 11.2, 4.9 Hz, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.6, 165.7, 162.4, 151.5, 139.4, 133.9, 133.9, 130.8, 129.6, 122.9, 122.2, 118.7, 118.4, 111.9, 111.3, 102.3。
实施例9。
N'-苯基-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-苯基-4-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得目标化合物0.41g ，收率：39.18%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ10.34 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.99 (dd, J = 18.2, 7.7 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.86 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.57 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.21 (dt, J = 15.6, 7.5 Hz, 3H), 6.82 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.50 (t, J = 7.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ166.1, 164.9, 161.0, 150.7, 150.0, 149.3, 141.4, 129.2, 129.1, 128.9, 128.8, 128.5, 125.3, 123.2, 122.9, 119.4, 119.0, 112.8, 112.7, 104.2。
实施例10 。
N'-(2-甲苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和邻甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲苯基)-4-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得黄色固体粉末0.41g ，即为目标化合物，收率：37.73%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.49 (s, 1H), 10.30 (s, 1H), 8.42 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.22 (s, 1H), 7.02 (dd, J = 11.6, 7.5 Hz, 2H), 6.73 – 6.63 (m, 2H), 2.21 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.1, 147.3, 142.3, 130.3, 128.8, 127.5, 126.8, 122.3, 119.0, 111.5, 17.7。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 165.0, 161.0, 151.1, 149.7, 147.1, 138.8, 134.3, 130.4, 129.6, 126.8, 123.0, 122.7, 122.3, 119.1, 119.0, 111.4, 104.1, 17.7。
实施例11。
N'-(3-甲苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和间甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲苯基)-4-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得黄色固体粉末0.39g ，即为目标化合物，收率：35.89%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.75 (s, 1H), 10.22 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.79 – 7.67 (m, 3H), 7.02 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.63 – 6.56 (m, 2H), 6.53 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 2.21 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.7, 166.3, 164.4, 163.2, 160.1, 150.1, 143.0, 138.1, 129.0, 128.7, 126.8, 119.8, 118.6, 113.3, 110.1, 99.5, 60.1, 21.7。
实施例12 。
N'-(3-氯苯基)-4-(尿嘧啶-5-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和间氯苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲苯基)-4-硝基-苯甲酰肼，并按照实施例1步骤（4）制得黄色固体粉末0.38g ，即为目标化合物，收率：33.18%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 11.59 (s, 1H), 10.31 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.89 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.16 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 6.83 – 6.67 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.3, 166.2, 163.4, 159.1, 157.3, 151.7, 142.7, 133.8, 130.8, 128.8, 126.9, 118.9, 118.3, 111.9, 111.3, 100.9。
实施例13 。
N'-苯基-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，并按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.42g ，即为目标化合物，收率：40.13%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.14 (d, J = 83.4 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.93 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.56 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.20 (dt, J = 41.3, 7.7 Hz, 4H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.73 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 166.2, 162.6, 151.6,149.6, 137.4, 131.3, 129.1, 128.5, 125.0, 123.7, 123.7, 119.0, 112.7, 103.8。
实施例14。
N'-(2-甲苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以邻甲基苯肼为原料，按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲基苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.44g ，即为目标化合物，收率：40.49%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.09 (d, J = 27.4 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.95 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.24 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.05 (s, 2H), 6.86 (s, 1H), 6.74 – 6.65 (m, 1H), 5.90 (s, 1H), 2.24 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 169.1, 166.9, 166.8, 166.8, 150.3, 146.6, 138.4, 132.5, 130.4, 128.9, 126.9, 123.6, 122.7, 121.0, 119.3, 119.0, 111.2, 17.8。
实施例15 。
N'-(3-甲苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲基苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体0.46g ，即为目标化合物，收率：42.33%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.03 (s, 1H), 8.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.03 – 7.86 (m, 2H), 7.56 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.23 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.05 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.70 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 6.56 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 2.22 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 167.0, 149.4, 138.5, 138.3, 129.1, 128.8, 123.5, 120.8, 120.3, 113.6, 110.3, 96.3, 21.7。
实施例16。
N'-(3-氯苯基)-2-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氯苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-氯苯基)-2-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体0.36g ，即为目标化合物，收率：31.43%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.11 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.64 (s, 2H), 7.16 (s, 2H), 6.73 (s, 4H), 6.55 (s, 1H), 6.39 (s, 2H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 169.2, 151.8, 150.3, 133.8, 132.7, 130.8, 128.3, 118.3, 116.8, 115.1, 112.8, 111.8, 111.2。
实施例17。
N'-苯基-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-苯基-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.39g ，即为目标化合物，收率：37.26%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.35 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.04 – 7.87 (m, 2H), 7.64 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.86 – 6.65 (m, 3H), 5.87 (s, 1H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 167.4, 166.7, 163.8, 159.9, 149.8, 138.7, 134.2, 129.3, 129.1, 123.0, 122.7, 119.2, 119.0, 112.7, 95.4。
实施例18。
N'-(2-甲苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和邻甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.33g ，即为目标化合物，收率：30.37%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 8.30 (s, 1H), 8.08 - 8.14 (m, 1H), 7.88 - 7.98 (m, 1H), 7.65 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.46-7.53 (m, 1H), 7.28-7.30 (m, 1H), 7.03 (d, J=7.2 Hz, 1H), 6.70 (d, J=8.1 Hz, 1H), 2.18 - 2.22 (m, 4H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.1, 151.4, 151.2, 148.1, 143.8, 134.2, 134.0, 133.9, 133.9, 130.9, 130.9, 129.7, 124.7, 121.6, 118.6, 118.5, 112.0, 111.9, 111.4, 111.3。
实施例19。
N'-(3-甲苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和间甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.35g ，即为目标化合物，收率：33.21%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 8.31 (d, J=7.7 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.85 - 7.94 (m, 1H), 7.75 - 7.84 (m, 1H), 7.66 - 7.74 (m, 1H), 7.62 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.46 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.03 - 7.13 (m, 1H), 6.60 - 6.66 (m, 1H), 2.14 - 2.24 (m, 4H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.0, 165.9, 161.7, 147.3, 138.2, 134.3, 129.6, 129.0, 128.9, 123.0, 119.9, 119.0, 113.2, 113.2, 113.2, 110.0, 21.7。
实施例20 。
N'-(3-氯苯基)-3-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以间氨基苯甲酸和间氯苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-氯苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.42g ，即为目标化合物，收率：36.67%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 11.32 (s, 1H), 10.43 (br. s., 1H), 8.39 (s, 1H), 8.19 - 8.27 (m, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.91 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.45 (t, J=7.9 Hz, 1H), 7.16 (t, J=8.0 Hz, 1H), 6.68 - 6.81 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ166.1, 151.4, 151.2, 148.1, 143.8, 134.2, 134.0, 133.9, 133.9, 130.9, 130.9, 129.7, 124.7, 121.6, 118.6, 118.5, 112.0, 111.9, 111.4, 111.3。
实施例21。
N'-苯基-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸为原料按照实施例1步骤合成N'-苯基-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.38g ，即为目标化合物，收率：36.31%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 8.40 (d, J=8.7 Hz, 1H), 8.26 - 8.32 (m, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.15 (d, J=2.3 Hz, 1H), 8.10 (d, J=8.5 Hz, 1H), 8.01 - 8.06 (m, 1H), 7.97 (dd, J=13.0, 2.6 Hz, 1H), 7.86 (d, J=2.6 Hz, 1H)。 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ150.0, 149.8, 149.7, 149.6, 129.2, 129.1, 128.9, 128.6, 128.5, 125.3, 123.2, 122.9, 119.6, 119.2, 119.1, 119.0, 112.8, 112.7。
实施例22。
N'-(2-甲苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和邻甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(2-甲苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.38g ，即为目标化合物，收率：34.79%。1H NMR (DMSO-d6 ,600MHz): δ 7.85 - 7.95 (m, J=8.5 Hz, 2H), 7.70 - 7.77 (m, J=8.5 Hz, 2H), 7.21 (br. s., 1H), 6.96 - 7.05 (m, 2H), 6.58 - 6.76 (m, 2H), 2.11 - 2.24 (m, 3H)。 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ 166.0, 165.9, 161.7, 147.3, 141.3, 130.3, 128.8, 128.6, 126.8, 122.3, 119.8, 119.1, 111.5, 98.5, 17.7。
实施例23。
N'-(3-甲苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和间甲基苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-甲苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.44g ，即为目标化合物，收率：40.49%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 9.86 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.60 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.60 – 6.48 (m, 6H), 5.68 (s, 2H), 2.19 (s, 3H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) d 166.7, 152.4, 150.5, 139.7, 138.0, 134.1, 133.0, 129.9, 128.9, 123.0, 121.0, 119.8, 119.6, 113.4, 113.2, 113.0, 110.0, 21.7。
实施例24 。
N'-(3-氯苯基)-4-(尿嘧啶-6-甲酰胺基)苯甲酰肼的制备方法。
以对氨基苯甲酸和间氯苯肼为原料按照实施例1步骤（1）合成N'-(3-氯苯基)-3-硝基-苯甲酰肼，再以尿嘧啶-6-甲酸为原料，按照实施例1步骤（3）合成尿嘧啶-6-甲酰氯，最后按照实施例1步骤（4）制得白色固体粉末0.40g ，即为目标化合物，收率：34.93%。1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 10.36 (s, 3H), 8.20 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 26.9, 8.5 Hz, 4H), 7.16 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.83 – 6.68 (m, 3H), 5.99 (s, 1H)。13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) d 166.4, 166.2, 162.6, 151.6, 141.5, 133.8, 130.8, 128.6, 128.2, 119.7, 118.4, 111.9, 111.3, 97.4。
一、体外对VEGFR-2激酶抑制活性实验。
利用Mobility Shift Assay的方法,在Km ATP的情况下,对体外激酶VEGFR-2进行化合物的筛选，采用化合物staurosporine作为标准对照，每个化合物稀释成10个浓度点进行单孔检测。
1.化合物的稀释。
在EP管中分别加入30pL的10 mM本发明制备的化合物,然后分别加入7μL的100% DMSO,配成100μL的2.5 mM本发明制备的化合物。将该EP管中的化合物分别转移到96孔板第二列中,从中取20^iL加入其后孔中,同时加入60μL 100% DMSO,按此比例依次稀释10个浓度,化合物浓度变化范围即2.5 mM至9.5 nM。在该96孔板上每行第一，和最后两个孔加入60μL的100% DMSO做空白对照。从上述96孔板上每孔吸取5μL加入另一 96孔板,并加入45μL超纯水。再从每孔转移5μL到384孔板中,即96孔板的A1中的溶液被转移到384孔板的A1和A2两个孔中,而A2中的溶液(化合物的最高浓度)被转移到384孔板的A3、 A4两个孔中,依次类推。因此,384孔反应板中就有5μL的10% DMSO溶解的5倍化合物。
2.激酶反应。
将激酶加入1倍激酶缓冲液,形成2.5倍酶溶液；将FAM标记的多肽和ATP加入1倍激酶缓冲液,形成2.5倍底物溶液；在已有5μL的10% DMSO溶解的5倍化合物的384孔反应板上加入lOμL 的2.5倍酶溶液；然后在室温下孵育10分钟；再向该384孔反应板中加入10μL的2.5倍底物溶液；28℃下孵育一定时间后,加25μL终止液终止反应。
3.抑制率计算。
从Caliper上读取转化率数据,把转化率转化成抑制率数据。
Percent inhibition = (max-conversion)/(max-min)* 100，max是指DMSO对照的转化率,min是指无酶活对照的转化率。
XLfit后获得IC50数据。
方程如下。
。
实验结果，见表1。
表1 目标化合物对VEGFR-2激酶抑制活性IC50 值。
其中A1-12是实施例1-12制备的化合物；B1-12是实施例13-24制备的化合物；以上实验数据显示，本发明中的化合物具有较好的VEGFR-2激酶抑制活性，因而为深入研究和开发新的抗肿瘤药物开辟了新的途径。