一种苯并噻二嗪酮类衍生物，其制备方法和用途与流程

本发明属于药物化学领域，具体地，涉及一种经取代的苯并噻二嗪类化合物及其制备方法和用途。

背景技术：

糖尿病是一种慢性病，当胰腺产生不了足够的胰岛素或者人体无法有效地利用所产生的胰岛素时，就会出现糖尿病。糖尿病可以分为三种：1.一型糖尿病，过去称为胰岛素依赖型，青少年或儿童期发病型糖尿病，特征是缺乏胰岛素分泌能力，需要每天注射胰岛素；2.二型糖尿病，过去称为非胰岛素依赖或成人发病型糖尿病，由于人体无法有效利用胰岛素造成；3.妊娠期糖尿病。

糖尿病随着时间的推移会对人体的许多系统带来严重损害，这些损害统称为糖尿病并发症，主要有心血管疾病、神经系统及肾功能的损伤等。

表1常见糖尿病并发症

糖尿病各种并发症的危害大，且不可逆，并发症一旦产生，药物治疗很难逆转；糖尿病并发症的发病率高，因此尽早预防糖尿病并发症是十分重要的。

目前针对糖尿病并发症的预防或者治疗的药物较少。由日本小野药品工业开发的于1992年上市的依帕司他(epalrestat)，是目前唯一在售的药物。由加拿大ayerst开发的于1989年首次在爱尔兰上市的托瑞司他(tolrestatin)因副作用较大已被撤销上市。另一种由日本的三合化学研究所(sanwakagakukenkyusho)开发的药物—醛糖还原酶抑制剂非达司他(fidarestat)，已通过三期临床试验，目前处于申请批准状态。除此之外，目前还有数十种针对糖尿病并发症的预防或者治疗的药物处在开发阶段，但较多存在效果不佳或者毒副作用严重的问题(zhangsetal.，effectofc7modificationsonbenzothiadiazine-1,1-dioxidederivativesontheirinhibitoryactivityandselectivitytowardaldosereductase，chemmedchem.2013apr；8(4):603-13)。

中国专利申请cn102600171a公开了一类苯并噻二嗪和吡啶并噻二嗪衍生物，以及该类化合物作为醛糖还原酶抑制剂在治疗或者预防糖尿病并发症中的应用，但该专利申请未公开此类化合物对神经等系统是否有保护作用。

因此，开发出新型的安全有效的预防或者治疗糖尿病并发症的药物具有重要意义。所以，本发明设计和合成了一系列具有预防或者治疗糖尿病并发症活性的新的化合物，并评价了它们的酶、细胞活性，及在大鼠实验中的有效性和安全性。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种具有治疗或者预防糖尿病并发症活性的苯并噻二嗪酮类衍生物。该类化合物具有式(i)所示的结构：

其中，x为卤素；

r1为-(ch2)n-羧基、被卤素取代的芳基或者芳烷基，或者未被取代的芳基或者芳烷基；

r2为-(ch2)n-羧基、被取代或未被取代的-(ch2)n-苯并噻唑基、被取代或未被取代的芳基或者芳烷基，其中所述的被取代是指被卤素、羟基、氨基、硝基、c1-c4烷氧基、或者c1-c4卤代烷基取代；

n是0，1，2或3。

在优选的实施方案中，上述化合物具有式ii所示的结构：

其中，x为卤素；

r1为-(ch2)n-羧基；

r4-r7为h、卤素、羟基、氨基、硝基、c1-c4烷氧基、或者c1-c4卤代烷基；

n是0，1，2或3。

优选地，本发明的化合物为选自：

[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[4-(2,4,5-三氟苄基)-7-氯-3-氧-4h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-2-烷基]乙酸，

[2-(2-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(3-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-硝基苄基)-7-氟-2h-1,2,4-苯并噻二嗪1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-硝基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-硝基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-甲氧基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(2-氟-4-溴苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(2-氟-4-溴苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-甲氧基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(3-氯苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-甲基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

(2-苄基-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基)乙酸，

[2-(4-甲基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

{2-[2-(6-三氟甲基)亚甲基苯并噻唑]-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸，

[2-(3-氯苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(3-氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

{2-[2-(4，6，7-三氟)亚甲基苯并噻唑]-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸，

{2-[2-(6-三氟甲基)亚甲基苯并噻唑]-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸，

[2-(2,4-二溴苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(2,4-二溴苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(4-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(2-硝基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，

[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸，和

{2-[2-(4，6，7-三氟)亚甲基苯并噻唑]-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸中的一种。

本发明的化合物在预防或者治疗糖尿病并发症中作为醛糖还原酶抑制剂起作用。

本发明的另一个目的在于提供一种用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物，该药物组合物包含本发明所述的化合物或者其水合物、溶剂化物、晶型盐、代谢产物、或者药学上可接受的盐或酯或前药，以及药学上可接受的载体。

优选地，本发明所述的药用组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂和外用剂型的剂型。

优选地，所述外用剂型为溶液剂、悬浮剂或者气雾剂。

本发明的所述化合物可以单独或者相互结合给药，也可以与其他药学上可接受的活性化合物联合给药。所述化合物可以药物组合物的形式通过口服、直肠、肠胃外、局部给药施予有需要的人或动物。

所述药物组合物通常根据常规方法将活性化合物与一种或多种药学上可接受的载体混合，制成合适的剂型。所述药学上可接受的载体指药学领域常规的惰性载体。

除了活性化合物外，药物组合物可包含以下一种或多种载体：稀释剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇或硅酸；粘合剂，如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；分散剂，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂，例如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；缓溶剂，如石蜡；吸收加速剂，如季胺化合物；润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；吸附剂，如高岭土；润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠；其他辅剂，如缓冲剂、着色剂、芳香剂、甜味剂等。此外，可包含包衣材料制备包衣制剂。可包含聚合物质和蜡类物质等制备缓释制剂，使活性化合物以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。

用于口服给药的液体剂型包括乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，药物组合物可包含以下一种或多种载体：稀释剂如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物；助悬剂，如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂。此外可包含辅剂，如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

用于肠胃外给药的剂型包括静脉内、皮下、肌内注射制剂。除了活性化合物外，药物组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的剂型包括软膏剂、散剂、喷射剂、滴剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

在本发明中，除另有说明外，下面的术语具有下述含义：

“卤素”指氟、氯、溴和碘，优选氟、氯或溴；

“c1-4烷基”指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；优选甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基；更优选甲基；

“c1-4烷氧基”指甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基；优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或丁氧基；更优选甲氧基；

“苯基”可以是被烷基、烷氧基、烷氧基甲基、酯基、磺酸酯基、羟基等取代的苯基，优选烷氧基、烷氧基甲基、酯基、羟基取代的苯基；

“芳基”指单环至三环的芳族烃基，如苯，萘或类似基团；

“芳烷基”指被上述芳基取代的c1-c4烃基，如苄基，萘甲基或类似基团；

“立体异构体”包括顺反异构体、对映异构体和构象异构体；

本发明所述的药学上可接受的盐或酯指的是可以根据本领域技术人员熟知的方法制备的药物工业中通常使用的无毒的盐或酯或其衍生物；一方面，基于碱性基团的盐优选氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐之类的氢齒酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐之类的低级链烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐之类的芳磺酸盐、马来酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、半富马酸盐、枸橼酸盐、丁二酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、丙二酸盐、醋酸盐、三氟醋酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐、草酸盐等有机酸盐；以及精氨酸盐、赖氨酸盐、甘氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天门冬氨酸盐之类的氨基酸盐；另一方面，基于酸性基团的盐优选钠盐、钾盐、锂盐之类的碱金属盐、钙盐、镁盐之类的碱土金属盐、铝盐，铁盐等金属盐；铵盐之类的无机盐、叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n，n’-二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐之类的有机盐等胺盐；以及精氨酸盐、赖氨酸盐、甘氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天门冬氨酸盐之类的氨基酸盐；应当理解的是所述的无毒的盐或酯包括本发明所述化合物的药学上可接受的药理学活性衍生物，或与其显著相关的化合物，包括但不限于盐或酯、药学上可接受的盐或酯、前体药物、活性代谢产物、各种异构体或这些异构体的任何比例的混合物、结晶、部分结晶、非晶形形式或多晶形式、溶剂合物、水合物或氧化物。

本发明所述的药学上可接受的载体是本领域公认的，并指参与运载或转运任何主题组合物或其组分从一个器官或身体的部分至另一个器官或身体的部分的药学上可接受的物质、组分或载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。所述的药学上可接受的载体可以选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、湿润剂、矫味剂、芳香剂、着色剂、溶解度促进剂或其混合物。药学上可接受的每种载体在药物组合物中的量可在本领域常规范围内变化。

本发明还有一个目的是提供一种制备本发明所述化合物的方法，包括下述步骤：

a、以卤代芳香胺(1)为原料，硝基甲烷为溶剂，用1.1-1.3个当量的氯磺酸异氰酸酯作为磺化剂，在-50℃至-25℃下反应2-3小时后再升温至室温下反应0.5-3小时，生成化合物(2)；

b、往由步骤a获得的反应液中加入1.1-2.0当量的无水三氯化铝，然后升温至100-110℃下反应2-5小时，分离得到化合物(3)；

c、将由步骤b获得的化合物(3)与1.0-1.3个当量的苄氯衍生物或者苄溴衍生物在0-130℃，缚酸剂存在的条件下反应8-24小时，溶剂为dmf或乙腈，反应生成化合物(4)；

d、将由步骤c获得的化合物(4)与1.0-1.3个当量的溴代乙酸烷基酯在0-130℃，缚酸剂存在的条件下反应8-24小时，溶剂为dmf或乙腈，反应生成化合物(5)；

e、将由步骤d获得的化合物(5)在hcl/meoh溶液中与三氟乙酸反应2-24小时，或者，在thf溶液中与碱的水溶液反应0.5-4小时，生成本发明所述的化合物(6)。

优选地，其中，步骤c和d所述的缚酸剂选自碳酸钾，碳酸钠，碳酸氢钾，碳酸氢钠，氢氧化钠和氢氧化钾中的一种；

步骤e所述的碱为氢氧化锂，氢氧化钠，或氢氧化钾。

所述方法的反应式为式(iii)：

其中，x为卤素；

r2为-(ch2)n-羧基、取代或未取代的-(ch2)n-苯并噻唑基、取代或未取代的芳基或者芳烷基，其中所述的取代是指被卤素、羟基、氨基、硝基、c1-c4烷氧基、或者c1-c4卤代烷基取代；

r3为c1-c4烷基。

本发明所述化合物的主要优点在于，药理实验表明，相对于阳性对照物依帕司他，本发明所述的此类化合物对alr2和alr1具有更好的活性和选择性；其在高糖环境下对细胞有更好的保护作用；在大鼠体内对神经系统具有更好的防护作用，可用于制备预防和治疗糖尿病并发症药物。

附图说明

图1表示通过电生理方法测量糖尿病大鼠的运动、感觉神经传导速度，并通过酶法测定坐骨神经中山梨醇含量的流程图；

图2表示化合物对链脲霉素(stz)诱导糖尿病大鼠的坐骨(sciatic)运动和感觉神经传导损伤的作用；其中，*：p<0.05vs模型组；

图3表示给药后三组大鼠的体重变化。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明的技术方案。这些实施例仅用于举例说明，不应解释为对本发明的限制。

以下实施例中的所有参数及说明，除另有说明外，都是以质量为依据。实施例中未注明具体条件的试验方法通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例中用到的检测仪器有：

核磁：500兆核磁共振波谱仪型号：avance500；

400兆核磁共振波谱仪型号：avance-ⅲ；

300兆核磁共振波谱仪型号：avance300；

质谱：四极杆飞行时间串联质谱仪型号：qstarelite；

四极杆-飞行时间质谱联用仪型号：安捷伦6540uhdaccurate-massq-toflc/ms；

高效液相色谱仪：安捷伦1260系列；

色谱柱：inertsilods-2，c18，5μm。

一、化合物的制备

实施例1：由1cl制备2cl

向一500ml的三口瓶中依次投入22.25克氯磺酰异氰酸酯，169.95克硝基甲烷，使用机械搅拌装置，做好反应体系密封。用干冰-乙醇体系降温至-30℃—-25℃时开始滴加17.22克对氯苯胺和113.3克硝基甲烷配置而成的溶液，约2-3小时滴完。滴完后自然升至室温25℃下再搅拌30分钟，tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：1)分析反应液，原料点消失即判断为反应终点，产物不用分离直接用于下一步反应。

实施例2：由2cl制备3cl

往2cl溶液中加入30.0克无水三氯化铝，升温至103℃左右开始回流反应，约2-3小时后tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：1)分析反应液，目测剩余30％-40％左右原料时，判断为反应终点，否则继续延长反应时间或者补加无水三氯化铝。

待反应液自然冷却至室温25℃左右后，将反应液倒入300克冰水中，5℃-8℃下搅拌1小时后低温过滤，20克冷水洗涤产物后，将产物置于真空干燥箱中-0.1mpa，40℃下干燥16小时，最终得到14.69克灰色固体，两步产率为56.77％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝11.40(s,1h),7.81(d,1h),7.68(m,1h),7.25(d,1h)。

实施例3：由1f制备2f

向一1000毫升的三口烧瓶中依次加入340.0克硝基甲烷，44.5克氯磺酰异氰酸酯，使用机械搅拌装置，做好反应体系密封。用干冰-乙醇体系降温至-30℃—-25℃时开始滴加33.2克对氟苯胺和226.0克硝基甲烷配置而成的溶液，约2-3小时滴完。滴完后自然升至室温25℃下再搅拌30分钟，tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：1)分析反应液，原料点消失即判断为反应终点，产物不用分离直接用于下一步反应。

实施例4：由2f制备3f

向2f的反应液中加入60.3克无水氯化铝,升温至回流开始反应,约3小时后tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：1)分析反应液,目测剩余30％-40％左右原料时，判断为反应终点，停止反应。

待反应液逐渐冷却至室温后，将体系倒入800.0克冰水中，低温下(5-10℃)搅拌30分钟后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，60℃-65℃下干燥16小时，最终得到29.4克深蓝色固体，两步反应产率为45.52％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝11.35(s,1h),7.66(m,1h),7.52(m,1h),7.30(m,1h)。

实施例5：制备[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：npt1401c)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.25克原料，1.90克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，50.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.98克2,4,5-三氟苄氯和10.0毫升dmf组成的溶液，20分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入26.20克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到1.3克棕色固体。

粗品采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1，最终得到180毫克白色固体。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝11.71(s,1h),7.99(d,1h),7.80(m,1h),7.57(m,1h),7.46(m,1h),7.32(m,1h),5.01(s,2h)。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入243毫克中间体，134毫克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，8.0ml的dmf，188毫克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(10ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(20ml)洗涤一次，再加入2.2克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到330毫克白色固体。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入330毫克中间体，10.0ml的hcl/meoh(2.6m)溶液，3.0ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入20ml冰水中，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取后，有机相用饱和nahco3洗涤，再加入2.5克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，得到342毫克粗品。

粗品通过制备色谱进行分离提纯，最终得到110毫克白色固体，hplc纯度为98.03％。

1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝7.93(d,1h),7.75(d,1h),7.34(m,2h),7.16(m,1h),5.08(s,2h),4.77(m,1h).

lcms:m/z867.1[2m-1]-

实施例6：制备[4-(2,4,5-三氟苄基)-7-氯-3-氧-4h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-2-烷基]乙酸(化合物编号：npt1402)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.25克原料，1.90克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，50.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.98克2,4,5-三氟苄氯和10.0毫升dmf组成的溶液，20分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入26.20克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到1.3克棕色固体。

粗品采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:1，最终得到180毫克白色固体。

1hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝7.96(d,1h),7.77(m,1h),7.52(m,2h),7.32(d,1h),5.01(s,2h)。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入243毫克中间体，134毫克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，8.0ml的dmf，188毫克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(10ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(20ml)洗涤一次，再加入2.2克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到310毫克白色固体。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入310毫克中间体，10.0ml的hcl/meoh(2.6m)溶液，3.0ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入20ml冰水中，用乙酸乙酯(20ml×3)萃取后，有机相用饱和nahco3洗涤，再加入2.5克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，得到320毫克粗品。

粗品通过制备色谱进行分离提纯，最终得到75毫克白色固体，hplc纯度为95.62％。

1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝7.93(s,1h),7.75(d,1h),7.34(m,2h),7.15(d,1h),5.08(s,2h),4.77(m,1h).

lcms:m/z867.1[2m-1]-

实施例7：制备[2-(2-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0421-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.00克原料，1.65克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，47.22克dmf，室温下搅拌30分钟后滴加2.08克邻氟苄溴和10.0毫升dmf组成的溶液，20分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入26.20克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到4.88克黄色油状物粗品。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.88克中间体，3.00克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，97.00克dmf，3.90克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入20.20克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到7.38克黄色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到2.27克白色固体。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.27克中间体，10ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，搅拌5min后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，65℃下干燥16小时，最终得到0.56克白色固体，hplc纯度为97.73％。三步反应收率为12.76％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝7.94(d,1h),7.75(m,1h),7.30(m,3h),7.13(m,2h),5.03(s,2h),4.26(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝399.0211(m+h)+。

实施例8：制备[2-(3-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0427-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.13克原料，0.94克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，24.15克dmf，室温下搅拌60分钟后滴加1.04克间氟苄溴和5.0毫升dmf组成的溶液，15分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入22.46克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到1.07克黄色油状物粗品。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.07克中间体，1.32克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，14.51克dmf，1.80克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤一次，再加入20.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到1.5克黄色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到1.00克白色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入1.00克中间体，10.0ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，搅拌5min后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，65℃下干燥16小时，最终得到0.84克白色固体，hplc纯度为95.70％。三步反应收率为38.28％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.96(d,1h),7.79(m,1h),7.36(m,1h),7.28(d,1h),7.14(m,3h),5.00(s,2h),4.24(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝399.0222(m+h)+。

实施例9：制备[2-(4-硝基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw13)

在100ml三口瓶中，加入1.1g原料和80mldmf，再加入1.3g碳酸氢钠固体(3eq)，常温下搅拌1h，然后加入1.2g对硝基溴苄，tlc跟踪反应，原料消失后，把反应液倒水中，用ea萃取三次，合并有机相，水洗5次，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，再用ea和hex混合溶剂打浆，过滤，抽干。

tlc显示原料消失，处理出来的1.4g固体，产率为78.32％。

在100ml两口瓶中，加入1.4g中间体和60ml重蒸过的thf，然后分批加入0.2g氢化钠(1.5eq)，加毕，搅拌15min，加入0.6ml溴乙酸甲酯(1.2eq)，加毕，tlc跟踪反应，原料消失后，把反应液倒至冰水中，用ea萃取三次，合并有机相，水洗，饱和食盐水洗，干燥浓缩，拌样，层析柱，洗脱剂为hex:ea＝15:1。

tlc显示原料消失，处理出来的1.0g黄色固体，产率为60.22％。

在100ml两口瓶中，加入1.0g中间体和30mlthf，再加入0.1g氢氧化锂溶于5ml水的溶液，tlc跟踪反应，原料消失后，把thf旋掉，把水相用稀盐酸调至酸性，用ea萃取两次，合并有机相，饱和食盐水洗，干燥，浓缩，然后用ea打浆，抽干。

tlc显示原料消失，处理出来的0.6g浅黄色固体，hplc纯度为100％，产率为62.05％。三步反应总收率为28.81％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝8.20(d,2h),7.85(m,1h),7.66(m,3h),7.32(m,1h),5.14(s,2h),4.23(s,2h)。

ms(-cesi):m/z＝407.9(m-h)-。

实施例10：制备[2-(4-硝基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw14)

参照hw13方法合成，hplc纯度为100％，三步反应收率为23.14％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.22(s,1h),8.21(d,2h),8.09(d,1h),7.89(m,1h),7.55(m,3h),5.16(s,2h),4.78(s,2h)。

ms(-cesi):m/z＝423.8(m-h)-。

ms(+cesi):m/z＝426.0161(m+h)+，443.0427(m+nh4)+。

实施例11：制备[2-(4-甲氧基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw12)

参照hw13方法合成，hplc纯度为96.76％，三步反应收率为27.53％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.28(s,1h),7.90(m,1h),7.69(m,1h),7.49(m,1h),7.27(d,2h),6.87(d,2h),4.92(s,2h),4.74(s,2h),3.71(s,3h)。

ms(-cesi):m/z＝392.9(m-h)-。

ms(+cesi):m/z＝416.9(m+na)+。

实施例12：制备[2-(2-氟-4-溴苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw1)

参照hw13方法合成，hplc纯度为96.59％，三步反应收率为32.64％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.97(d,1h),7.81(t,1h),7.53(m,1h),7.37(m,1h),7.30(m,2h),5.00(s,2h),4.34(s,2h)。

ms(-cesi):m/z＝474.7(m-h)-。

ms(+cesi):m/z＝498.7(m+na)+。

实施例13：制备[2-(2-氟-4-溴苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw2)

参照hw13方法合成，hplc纯度为97.36％，三步反应收率为29.75％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.83(m,1h),7.65(m,1h),7.54(m,1h),7.38(m,1h),7.31(m,2h),4.99(s,2h),4.25(s,2h)。

ms(-cesi):m/z＝458.8(m-h)-。

ms(+cesi):m/z＝487.7(m+na)+。

实施例14：制备[2-(4-甲氧基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw11)

参照hw13方法合成，hplc纯度为100％，三步反应收率为26.44％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.17(s,1h),8.04(d,1h),7.85(m,1h),7.48(d,1h),7.27(d,2h),6.87(d,2h),4.93(s,2h),4.75(s,2h),3.71(s,3h)。

ms(-cesi):m/z＝408.8(m-h)-。

实施例15：制备[2-(3-氯苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-4)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.00克原料，1.30克碳酸钾，15.0ml的dmf，1.05克间氯苄溴，升温至110℃反应5小时后停止反应。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到0.65克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入0.65克中间体，0.75克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，23.0ml的dmf，0.70克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×6)洗涤六次，旋蒸除去溶剂，最后得到0.73克黄色固体粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到0.30克淡黄色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入0.30克中间体，2.0ml三氟乙酸，室温反应2h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用200ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相为弱酸性至中性(ph＝6)，蒸出溶剂，干燥，得到0.13克淡黄色固体。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯的梯度洗脱，最终得到30毫克白色固体，hplc纯度为100％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.96(d,1h),7.80(m,1h),7.41(s,1h),7.31(m,4h),4.99(s,2h),4.22(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝414.9926(m+h)+。

实施例16：制备[2-(4-甲基苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：whh-0142)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.00克原料，2.00克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，32.00克dmf，室温下搅拌30分钟后滴加2.02克对甲基苄溴和5.0毫升dmf组成的溶液，18分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，再加入20.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到6.80克黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入6.80克中间体，3.07克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，28.00克dmf，4.35克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(200ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，再加入35.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到5.21克黄色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到2.42克淡黄色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入2.42克中间体，15.0ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入80ml冰水中，有大量白色固体析出，搅拌5min后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，65℃下干燥16小时，得到2.01克白色粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：丙酮＝8:1-1:10的梯度洗脱，最终得到0.92克白色固体，hplc纯度为96.20％。三步反应收率为21.35％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.22(s,1h),8.04(d,1h),7.86(m,1h),7.48(d,1h),7.21(d,2h),7.12(d,2h),4.95(s,2h),4.76(s,2h),2.25(s,3h)。

ms(+cesi):m/z＝395.0476(m+h)+。

实施例17：制备(2-苄基-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基)乙酸(化合物编号：wj-0435-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.25克原料，1.90克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，50.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.88克苄溴和10.0毫升dmf组成的溶液，25分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入60克冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，再加入15.0克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到3.32克土黄色固体。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到2.25克白色固体，收率为63.42％。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.00克中间体，0.96克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，25.00克dmf，1.07克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(100ml×3)洗涤三次，再加入20.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到黄色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到1.10克淡黄色油状物。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入1.10克中间体，10.0ml三氟乙酸，室温搅拌过夜。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，搅拌15min后，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取后，有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)洗涤ph值为5后，再加入22.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到黄色油状物。

往黄色油状物加入5ml乙酸乙酯和5ml石油醚溶解，再加入10ml水后蒸除有机溶剂，过滤，干燥后得到0.65克白色粉末状固体，hplc纯度为97.05％。三步反应收率为15.53％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝7.94(d,1h),7.79(m,1h),7.30(m,6h),4.98(s,2h),4.22(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝398.0601(m+nh4)+。

实施例18：制备[2-(4-甲基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0455-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.2克原料，1.0克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，25.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.2克对甲基苄溴和5.0毫升dmf组成的溶液，25分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入40克冰水中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(100ml×3)洗涤三次，再加入20.0克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到4.28克墨绿色固体。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入4.28克中间体，2.8克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，30.00克dmf，3.0克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(100ml×3)洗涤三次，再加入20.00克无水硫酸钠干燥2小时后过滤，旋蒸除去溶剂，最后得到黄色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到1.01克白色固体。

在100ml单口瓶中，加入1.01g中间体，29.2gthf，再加入0.2g氢氧化锂溶于10ml水的溶液，tlc跟踪反应，原料消失后，把thf旋掉，把水相用稀盐酸调至酸性，用ea萃取两次，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩，得到淡绿色粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：丙酮＝8:1-1:10的梯度洗脱，最终得到0.71克白色固体粉末，hplc纯度为100％。三步反应收率为28.94％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝8.20(s,1h),7.83(m,1h),7.60(m,1h),6.62(d,2h),6.28(d,2h),4.92(s,2h),4.59(s,2h),2.22(s,3h)。

ms(+cesi):m/z＝379.0757(m+h)+。

实施例19：制备{2-[2-(6-三氟甲基)亚甲基苯并噻唑]-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸(化合物编号：hw8-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为96.66％，三步反应收率为23.36％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝8.33(s,1h),8.31(s,1h),7.92(m,1h),7.75(d,1h),7.70(m,1h),7.44(d,1h),5.47(s,2h),4.54(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝511.9964(m+na)+,490.0154(m+h)+。

实施例20：制备[2-(3-氯苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-5)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入3.0克原料，3.5克碳酸钾固体颗粒，45.0ml的dmf，1.7克间氯苄溴，升温至105℃反应6小时后停止反应。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(300ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到2.42克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.42克中间体，2.90克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，80.0ml的dmf，2.70克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×6)洗涤六次，旋蒸除去溶剂，得到油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到1.67克淡黄色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入1.67克中间体，6.0ml三氟乙酸，室温反应2h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用300ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相为弱酸性至中性(ph＝6)，蒸出溶剂，干燥，得到1.20克淡黄色固体。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯的梯度洗脱，最终得到0.90克白色固体，hplc纯度为96.63％。三步反应收率为27.27％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.22(s,1h),7.94(m,1h),7.72(m,1h),7.53(m,1h),7.36(m,3h),7.28(m,1h),5.01(s,2h),4.77(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝399.0215(m+h)+。

实施例21：制备[2-(4-氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-6)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入3.0克原料，2.3克碳酸钾固体颗粒，45.0ml的dmf，1.5克4-氟苄溴，升温至105℃反应7小时后停止反应。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(300ml×5)洗涤五次，旋蒸除去溶剂，最后得到2.03克淡红色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.03克中间体，1.28克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，66.0ml的dmf，1.80克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，搅拌2h后过滤，然后干燥，最终得到1.55克淡红色固体。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝12:1-2:1的梯度洗脱，最终得到0.55克淡红色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入0.55克中间体，4.0ml三氟乙酸，室温反应2h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用100ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相为弱酸性至中性(ph＝6)，蒸出溶剂，干燥，得到0.27克白色固体。hplc纯度为100％，三步反应收率为8.90％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.19(s,1h),7.93(m,1h),7.71(m,1h),7.51(m,1h),7.37(m,2h),7.16(t,2h),4.99(s,2h),4.76(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝400.0777(m+nh4)+。

实施例22：制备[2-(3-氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-7)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.0克原料，0.96克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，30.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.4克3-氟苄溴和10.0毫升dmf组成的溶液，35分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×4)洗涤四次，旋蒸除去溶剂，最后得到2.36克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.36克中间体，1.40克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，80.0ml的dmf，1.80克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×4)洗涤四次，旋蒸除去溶剂，最后得到2.30克黄色固体粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-2:1的梯度洗脱，最终得到1.20克白色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入1.20克中间体，3.0ml三氟乙酸，室温反应3h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用200ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相至中性(ph＝7)，蒸出溶剂，干燥，得到0.70克白色固体。hplc纯度为98.34％，三步反应收率为24.72％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.22(s,1h),7.94(m,1h),7.72(m,1h),7.53(m,1h),7.39(m,1h),7.13(m,3h),5.03(s,2h),4.77(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝383.0510(m+h)+。

实施例23：制备[2-(4-硝基苄基)-7-氟-2h-1,2,4-苯并噻二嗪1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0529-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入0.46克中间体，0.81克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，8.0ml乙腈，0.39克4-硝基苄溴，升温至80℃时开始回流反应，2小时后tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失,反应结束。

旋蒸除去乙腈，加入12.0克水室温20℃-25℃下打浆30分钟后，过滤，干燥，最终得到灰色粉末状固体粗品，粗品直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入上步反应得到的中间体，10.6克1,4-二氧六环，2.0克水，2.5克氢氧化钠，室温20℃-25℃下反应16小时。tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失，反应结束。

将反应液倒入50.0克冰水中，搅拌5min后用稀盐酸调节体系ph值，至有大量白色固体析出时停止，此时体系ph＝2，静置2小时后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，60℃下干燥16小时，最终得到0.52克淡黄色粉末状固体，hplc纯度为96.64％，两步收率为77.97％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝12.99(s,1h),8.24(d,2h),7.64(d,2h),7.52(m,1h),7.40(m,1h),6.84(m,1h),4.93(s,2h),4.42(s,2h),4.21(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝396.0660(m+h)+。

实施例24：制备{2-[2-(4，6，7-三氟)亚甲基苯并噻唑]-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸(化合物编号：hw4-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为99.48％，三步反应收率为29.87％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.94(d,1h),7.85(m,1h),7.73(m,1h),7.38(m,1h),5.50(s,2h),4.28(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝476.0031(m+h)+。

实施例25：制备{2-[2-(6-三氟甲基)亚甲基苯并噻唑]-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸(化合物编号：hw7-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为98.78％，三步反应收率为25.46％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.30(s,1h),8.37(d,2h),8.16(s,1h),7.95(d,1h),7.81(d,1h),7.60(d,1h),5.54(s,2h),4.84(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝505.9892(m+h)+。

实施例26：制备[2-(2,4-二溴苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw9-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为98.34％，三步反应收率为26.57％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝8.04(d,1h),7.88(m,1h),7.84(d,1h),7.54(m,1h),7.44(d,1h),7.12(d,1h),5.01(s,2h),4.59(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝536.8551(m+h)+。

实施例27：制备[2-(2,4-二溴苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：hw10-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为99.32％，三步反应收率为27.19％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.96(d,1h),7.93(d,1h),7.89(d,1h),7.57(m,2h),7.11(d,1h),5.02(s,2h),4.75(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝520.8853(m+h)+。

实施例28：制备[2-(4-氟苄基)-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-3)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.00克原料，0.86克碳酸钾，15.0ml的dmf，0.80克4-氟苄溴，升温至100℃反应4小时后停止反应。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml)萃取后，有机相用饱和食盐水(50ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到0.49克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入0.49克中间体，0.30克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，16.0ml的dmf，0.40克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(100ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到0.54克红色油状物粗品。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9:1-2:1的梯度洗脱，最终得到0.34克红色油状物。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入0.34克中间体，2.0ml三氟乙酸，室温反应2h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用300ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相为弱酸性至中性(ph＝6)，蒸出溶剂，干燥，得到0.31克淡红色油状物。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯的梯度洗脱，最终得到0.12克白色固体，hplc纯度为95.26％。

1hnmr(500mhz,[d6]dmso):δ＝13.13(s,1h),8.05(d,1h),7.86(m,1h),7.49(d,1h),7.37(m,2h),7.16(m,2h),4.99(s,2h),4.76(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝416.0483(m+nh4)+。

实施例29：制备[2-(2-硝基苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-8)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.0克原料，0.48克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，15.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加0.8克2-硝基苄溴和10.0毫升dmf组成的溶液，35分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(70ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(100ml×4)洗涤四次，旋蒸除去溶剂，最后得到1.1克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入1.1克中间体，0.64克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，40.0ml的dmf，0.91克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到1.0克黄色油状物。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-2:1的梯度洗脱，最终得到0.22克白色固体。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入0.22克中间体，2.0ml三氟乙酸，室温反应3h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用200ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相至中性(ph＝7)，蒸出溶剂，干燥，得到0.40克油状物。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯的梯度洗脱，最终得到0.16克白色固体。hplc纯度为96.61％，三步反应收率为10.56％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝8.09(d,1h),7.97(m,1h),7.69(m,2h),7.56(t,1h),7.43(d,1h),7.35(m,1h),5.34(s,2h),4.27(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝427.0728(m+nh4)+。

实施例30：制备[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氟-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：lw-9)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.0克原料，1.02克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，24.0ml的dmf，室温下搅拌30分钟后滴加1.56克2,4,5-三氟苄溴和10.0毫升dmf组成的溶液，35分钟滴完，然后室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×3)洗涤三次，旋蒸除去溶剂，最后得到2.1克淡黄色固体。粗品无需提纯，直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入2.1克中间体，1.14克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，80.0ml的dmf，1.27克溴乙酸叔丁酯，室温搅拌过夜。

将反应液倒入冰水中，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取后，有机相用饱和食盐水(200ml×4)洗涤四次，旋蒸除去溶剂，最后得到1.3克黄色油状物。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝15:1-2:1的梯度洗脱，最终得到0.9克浅黄色油状物。

向一100毫升的单口烧瓶中依次投入0.9克中间体，2.0ml三氟乙酸，室温反应2h。

tlc判断反应结束后，将反应液倒入50ml冰水中，有大量白色固体析出，

用200ml乙酸乙酯萃取，5％nahco3洗涤有机相至中性(ph＝7)，蒸出溶剂，干燥，得到浅黄色油状物。

粗品采用柱层析提纯，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯的梯度洗脱，最终得到0.3克白色固体。hplc纯度为97.36％，三步反应收率为10.34％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝7.82(m,1h),7.64(m,1h),7.60(m,1h),7.38(m,1h),7.34(m,1h),5.00(s,2h),4.24(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝419.0325(m+h)+。

实施例31：制备{2-[2-(4，6，7-三氟)亚甲基苯并噻唑]-7-氯-3-氧-2h-1,2,4-苯并噻二嗪酮1,1-二氧-4-烷基}乙酸(化合物编号：hw3-2015)

参照hw13方法合成，hplc纯度为98.11％，三步反应收率为22.41％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝8.07(d,1h),7.88(m,2h),7.36(m,1h),5.51(s,2h),4.32(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝491.9733(m+h)+。

实施例32：制备[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氟-2h-1,2,4-苯并噻二嗪1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0525-1的合成)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入0.54克中间体，0.70克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，10.00克乙腈，0.49克2,4,5-三氟苄氯，升温至76℃时开始回流反应，3小时后tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失,反应结束。

旋蒸除去乙腈，加入10.0克水室温20℃-25℃下打浆30分钟后，过滤，将得到的湿品产物直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入上步反应得到的中间体，10.3克1,4-二氧六环，2.5克水，2.0克氢氧化钠，室温20℃-25℃下反应16小时。tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失，反应结束。

将反应液倒入50.0克冰水中，搅拌15min后用稀盐酸调节体系ph值，至有大量白色固体析出时停止，此时体系ph＝2，体系静置过夜后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，60℃下干燥16小时，最终得到0.80克灰白色粉末状固体，hplc纯度为98.98％，两步收率为96.90％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.00(s,1h),7.55(m,3h),7.39(m,1h),6.83(m,1h),4.89(s,2h),4.27(s,2h),4.23(s,2h)。

ms(+cesi):m/z＝405.0525(m+h)+。

实施例33：制备[2-(2,4,5-三氟苄基)-7-氯-2h-1,2,4-苯并噻二嗪1,1-二氧-4-烷基]乙酸(化合物编号：wj-0533-1)

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入0.52克中间体，0.71克颗粒状碳酸钾固体(西陇化工)，8.0ml乙腈，0.42克2,4,5-三氟苄氯，升温至80℃时开始回流反应，3小时后tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失,反应结束。

旋蒸除去乙腈，加入15.0克水室温20℃-25℃下打浆30分钟后，过滤，将得到的湿品产物直接用于下一步反应。

向一250毫升的单口烧瓶中依次投入上步反应得到的中间体，10.0克1,4-二氧六环，2.0克水，2.5克氢氧化钠，室温20℃-25℃下反应16小时。tlc(使用的展开剂为pe:ea＝1：2)分析反应液，原料点消失，反应结束。

将反应液倒入50.0克冰水中，搅拌5min后用稀盐酸调节体系ph值，至有大量白色固体析出时停止，此时体系ph＝3，体系静置过夜后过滤，将得到的固体置于真空干燥箱中-0.1mpa，60℃下干燥16小时，最终得到0.69克白色粉末状固体，hplc纯度为97.26％，两步收率为91.41％。

1hnmr(400mhz,[d6]dmso):δ＝13.06(s,1h),7.56(m,4h),6.84(d,1h),4.92(s,2h),4.25(d,2h)。

ms(+cesi):m/z＝421.0232(m+h)+。

二、药理试验

以下试验均以依帕司他(epalrestat，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)作为阳性对照物。

实施例34：化合物对醛糖还原酶alr2和醛还原酶alr1的体外抑制作用试验1、储液配制

10×化合物工作液：

对本发明的26个化合物进行了初筛，表3列出了待测的27个化合物，其中依帕司他作为阳性对照物。

将本发明的26个待测化合物和对照物依帕司他分别用dmso溶解至100mm作为储存液，各取1μl加入99μldmso中，得到的化合物为1mm。取2μl浓度为1mm的化合物至18μl的酶反应缓冲液中，得到100μm含10％dmso的化合物溶液；混匀后吸取2μl加入18μl含10％dmso的酶反应缓冲液的孔中，得到10μm含10％dmso的化合物溶液；每份稀释溶液各取5μl加入96孔板中，这样在最后的50μl反应体系中各个孔的化合物的终浓度为10μm和1μm；

同时，选取化合物依帕司他作为阳性参考化合物，从50μm开始3倍倍比稀释化合物，共10个浓度，即终浓度分别为50,16.6667,5.5556,1.8519,0.6173,0.2058,0.0686,0.0229,0.0076,0.0025μm。

10×nadph工作液：0.1mnadph储液20倍稀释至5mm，反应时，取5μl稀释液至50μl的反应体系中。

10×dl-甘油醛工作液：0.2mdl-甘油醛储液10倍稀释至20mm，反应时，取5μl稀释液至50μl的反应体系中。

饱和硫酸铵：取500g硫酸铵加入1l水中室温溶解过夜，过滤后取上清。

alr2酶缓冲液a：10mm磷酸钠缓冲液，ph7.2(含有0.25m蔗糖；2.0mmedta二钾；2.5mmβ-巯基乙醇)。

alr2酶缓冲液b：10mm磷酸钠缓冲液，ph7.2(含有2.0mmedta二钾；2.0mmβ-巯基乙醇)。

2、试验步骤

2.1alr2和alr1的制备

alr2的提取：从正常杀死的老鼠眼球中迅速提出晶状体，然后加入5倍体积比的冷去离子水，再用匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为40％，然后在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为50％，继续在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为75％，最后在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，即为alr2的水溶液，用考马斯亮蓝蛋白定量后低温保存备用。

alr1的提取：将大鼠断颈处死，迅速取出肾脏，然后加入3倍体积比的alr2酶缓冲液a，再用匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以16000g转速，0-4℃的温度，离心30min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为40％，然后在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为50％，继续在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min。取上清液，上清液中加入饱和的(nh4)2so4溶液使得混合液饱和度为75％，最后在低温离心机中以10000g转速，0-4℃的温度，离心20min，保留沉淀。沉淀用alr2酶缓冲液b复溶解后进行蛋白定量为20mg/ml，加入cellulose-deaede52resin(33mg/ml)充分混合15分钟后离心去除，保留上清，即为alr1的水溶液，低温保存备用。

2.2alr1酶反应和alr2酶反应

alr1酶反应和alr2酶反应的步骤及结果检测步骤见表2：

表2

2.3试验结果

由上述步骤2的测量结果得到时间与吸光度线性关系以及od值平台期，取线性关系至平台期的转折点读数，在附近多取几个时间点，本反应体系一般在35-45min处，通常这几个点获得的抑制率及ic50值相似。

抑制率用以下公式计算：

抑制率＝[od(全酶)-od(化合物)]/[od(全酶)-od(空白对照)]×100％

ic50的测定：100mm的储存液，取1μl加入99μldmso中，得到的化合物为1mm。取2μl浓度为1mm的化合物至18μl的酶反应缓冲液中，得到100μm含10％dmso的化合物溶液，混匀后各吸取5μl加入下一个10μl含10％dmso的酶反应缓冲液的孔中，依次3倍倍比稀释下去得到10个浓度梯度。每个稀释溶液各取5μl加入96孔板中，这样在最后的50μl反应体系中各个孔的化合物的终浓度分别为100，33.3333，11.1111，3.7037，1.2346，0.4115，0.1372，0.0457，0.0152，0.0051μm并含有1％dmso。10个测定浓度每个浓度为复孔。

化合物在体外抑制alr2和alr1活性的能力如表3所示：

表3化合物对alr1与alr2的抑制活性(ic50)

表3的实验结果表明，本发明的化合物在体外对alr2有明显的抑制作用，这些化合物对alr2的抑制活性强于依帕司他(epalrestat)，且对alr1抑制作用相对较低，其ic50alr1/ic50alr2均大于ic50epalrestat，结果说明这些化合物具有高选择性，并选择性优于已上市药物epalrestat。

尤其是化合物npt1401c和npt1402，其抑制活性强于依帕司他，且它们对alr1没有明显的抑制作用，说明这些化合物具有高选择性。

实施例35：高糖环境下化合物对huvec的保护作用

1、试验材料

细胞株:

huvec人脐静脉内皮细胞株(订购于sciencellresearchlaboratories,cat#8000,lot#11233)；

试剂和耗材：

cellcountingkit-8细胞计数试剂盒(cat#ck04-13，dojindo)；

96孔培养板(cat#3599，corningcostar)；

培养基和胎牛血清(gibco)；

培养基ecm内皮细胞培养基(cat#1001，sciencellresearchlaboratories)；

葡萄糖(sigma，cat#g7021-100g)；

台式酶标仪spectramaxm5microplatereader(moleculardevices)；

表4培养基的配制

化合物溶液的制备：用dmso稀释化合物使化合物的终浓度为10mm。

2、试验步骤

ic50测定实验(cck-8检测)：

收集对数生长期的huvec细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育24小时；

更换培养基,设为3个组：常规培养对照组，50mm葡萄糖组和100mm葡萄糖组。用培养基将待测化合物稀释至所设置的相应作用浓度，按25μl/孔加入细胞。化合物的作用终浓度为100nm,1μm和10μm；

细胞置于37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育72小时；

吸弃培养基，加入含10％cck-8的完全培养基置于37℃培养箱中孵育1-4小时；

轻轻震荡后在spectramaxm5microplatereader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

3、试验结果

按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率％＝[(ac-as)/(ac-ab)]×100％

as:样品的oa(细胞+cck-8+待测化合物)

ac:阴性对照的oa(细胞+cck-8+dmso)

ab:阳性对照的oa(培养基+cck-8+dmso)

运用软件graphpadprism5进行作图.

表5化合物对huvec细胞活性的影响(相对细胞存活率，％)

*：p<0.05vsepalrestat

从表中多个结果可以看出，在高糖环境下，本发明合成的多个化合物对细胞huvec的保护作用明显强于依帕司他。

实施例36：药代动力学实验

1、受试物配制

称取3.2mgnep-ypst(依帕司他)，溶于0.32mldmso，涡旋1min，超声1min，加入6.08ml的20％hp-β-cd水溶液中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为0.5mg/ml，为黄色澄清液体(ph7～8)，用于静脉给药；

称取10.4mgnep-ypst，溶于0.52mldmso，涡旋1min，超声1min，加入9.88ml20％hp-β-cd水溶液中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为1mg/ml，为黄色澄清液体(ph7～8)，用于口服给药；

称取3.2mghw2-2015，溶于6.40ml注射用水中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为0.5mg/ml，为无色澄清液体(ph7～8)，用于静脉给药；

称取10.4mghw2-2015，溶于10.40ml注射用水中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为1mg/ml，为无色澄清液体(ph7～8)，用于口服给药；

称取3.2mghw13-2015，溶于6.40ml注射用水中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为0.5mg/ml，为无色澄清液体(ph7～8)，用于静脉给药；

称取10.4mghw13-2015，溶于10.40ml注射用水中，涡旋1min，超声1min，配置浓度为1mg/ml，为无色澄清液体(ph7～8)，用于口服给药；

用hplc-uv检测给药溶液浓度。结果如表6所示：

表6hplc-uv检测给药溶液浓度

2、给药

雄性sd大鼠18只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。按表7给药。口服组给药前禁食10-14小时。给药后4小时后恢复给食。

表7给药剂量与给药方式

3、结果

3.1详细临床观察

给药前未观察到明显异常状况；

静脉和口服给药后，各个采血时间点未观察到明显异常状况；

3.2样本采集及处理

动物采血时间点为：

静脉：给药前，给药后5min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，和24h。

口服：给药前，给药后5min，10min，15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h，和24h。

每只动物每次颈静脉采约0.2ml血液，肝素钠抗凝。血液样本采集后置于冰上，离心分离血浆(离心条件：8000转/分钟，6分钟，4℃)。收集的血浆分析前存放于–70℃。

3.3分析方法及结果

色谱条件显示空白血浆不干扰化合物及内标的测定。线性回归分析是以峰面积为y轴，以药物浓度为x轴。峰面积比和浓度之间的线性关系用由化合物的回归方程所得的相关系数(r)来表示。配制好的质控样品进行分析，结果显示此试验方法可重复且可靠。

药代动力学结果见表8：

表8药代动力学结果

上表中的nep-ypst即为阳性对照物—依帕司他。

从药代动力学实验结果可以看出，上表中的2个代表化合物的半衰期比依帕司长得多，且其血液浓度也远高于依帕司他，从而可能减少给药频率和给药剂量。

实施例37：动物实验

1、试验方法

通过电生理方法测量糖尿病大鼠的运动、感觉神经传导速度，并通过酶法测定坐骨神经中山梨醇含量，进而测定化合物hw2-2015、hw11-2015、hw13-2015对链脲霉素(stz)诱导糖尿病大鼠神经传导及代谢损伤的改善作用。

1.1通过电生理方法测量糖尿病大鼠的运动、感觉神经传导速度。

1.1.1实验材料及设备

实验动物：本实验使用成年雄性sd大鼠，200g/只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验开始之前，动物需至少适应饲养环境3天。睿智化学动物房温度范围为20-24℃，湿度为40-70％，通风为10-15次/小时，保持12/12小时的昼夜节律，灯关开启时间段为5:00-17:00，动物自由采食、饮水。所有动物饲养及动物实验操作人员均已获得实验动物上岗证并完成相关培训。实验检测及给药人员为双盲原则操作。

实验药物：streptozotocin：sigma,货号:18883-66-4,-20℃保存；化合物hw2-2015、hw11-2015、hw13-2015：均由海王生物提供，4℃保存；所有溶液均新鲜配制；链脲霉素溶于0.1m柠檬酸钠缓冲液(ph＝4.5)；化合物hw2-2015、hw11-2015、hw13-2015(20mg/ml)均溶于0.5％cmc。

测试仪器和设备：血糖仪及试纸(稳豪型血糖试纸，强生)；天平(mettlertoledo)；小动物恒温温控系统(harvardapparatus,usa)；恒压刺激隔离器(digitimerltd.england)；cambridgeelectronicdesign1401interfacecoupledtoacomputerwithspike2software(cambridge,unitedkingdom)；高通量酶标仪(moleculardevices)；离心机(eppendorf)。

1.1.2实验操作

按照图1所示流程操作，图1为通过电生理方法测量糖尿病大鼠的运动、感觉神经传导速度，并通过酶法测定坐骨神经中山梨醇含量的流程图。

实验分组及给药

分组：

空白对照组：

stz-vehicle组(正常组)：0.5％cmc，5ml/kg,p.o.；

模型组(阴性溶剂组)：0.5％cmc,5ml/kg,p.o.；

hw2-2015组：100mg/kgin0.5％cmc,p.o.；

hw11-2015组：100mg/kgin0.5％cmc,p.o.；

hw13-2015组：100mg/kgin0.5％cmc,p.o.；

stz诱导糖尿病大鼠模型：

stz溶于0.1m柠檬酸钠(ph＝4.5)，于冰上新鲜配置，避光。

sd大鼠经腹腔注射stz(75mg/kg)，分别于stz注射后1h、24h口服15％葡萄糖1ml。

stz注射后72h和10天后动物禁食6小时，取尾静脉采血测定血糖，凡血糖大于16.7mmol/l者，被纳入实验，分为阴性溶剂组与不同的给药组。腹腔内未注射stz的大鼠作为空白对照组。

电生理记录：

大鼠(随机选取)末次给药后6h，以1.2g/kg乌拉坦经腹腔麻醉，放置于恒温毯，使其体温维持在37±0.5℃。

1)sciatic感觉和运动神经传导速度(sciaticmotorandsensorynerveconductionvelocity,sciaticmncvandsciaticsncv)

记录位置：骨间肌肉

记录方法：用两根尖端直径为0.25mm的针灸针为正负电极插入骨间肌肉，复合肌肉动作电位(compoundmuscleactionpotential,mwave)和h反射(hreflex)经数模转换并放大1000倍后由信号采集器采集。

刺激位置：坐骨神经槽(sciaticnotch,sn)，跟腱(achillestendon，at)

刺激方法：分别用两根尖端直径为0.25mm的针灸针为正负电极插入sn和at，经恒压刺激隔离器连续给入10次强度为8v，持续时间为100μs，间隔时间为3s的电刺激。

计算方法：取10次诱发mwave和hreflex的平均。

sciaticmncv＝sn到at的距离/刺激位点分别位于sn和at时所诱导m波波峰的潜伏期差值

sciaticsncv＝sn到at的距离/刺激位点分别位于sn和at时所诱导h波波峰的潜伏期差值。

2)感觉神经纤维传导速度(sensorynervefiberconductionvelocity,sncv)

刺激第二指神经，记录坐骨神经槽感觉神经纤维a、c-fiber的诱发电位(a,b,c)，观察海王化合物对stz诱导糖尿病大鼠感觉神经纤维传导速度(d,e)的影响。one-wayanova,dunnettposthoctest，vs模型组,*p<0.05

记录位置：坐骨神经槽(sciaticnotch,sn)

记录方法：用两根尖端直径为0.25mm的针灸针为正负电极插入sn，感觉神经纤维a/c-fiber诱发电位经数模转换并放大2000倍后由信号采集器采集。

刺激位置：第二指神经

刺激方法：用两根尖端直径为0.25mm的针灸针为正负电极插入皮下第二指神经，经恒压刺激隔离器从低到高依次给入电刺激，以同时诱导出a-fiber和c-fiber诱发电位的刺激强度为阈值，继而连续给入10次强度为其阈值，持续时间为100μs,间隔时间为3s的电刺激。

计算方法：取10次a/c-fiber诱发电位的平均。

sncn＝第二指神经到坐骨神经槽间距离/a-fiber或c-fiber的应答潜伏期。

取材：动物断颈处死，取双侧坐骨神经，称重后于-80℃保存。

山梨醇含量测定

试剂材料：

三氯乙酸(分析纯)，碳酸钾(分析纯)，山梨醇检测试剂盒(megazymek-sorb)

方法：

样品处理：取坐骨神经，称重后分别用4％三氯醋酸充分匀浆(坐骨神经体积浆液终体积为1.5ml)。3000r/min离心15min，取上清，用0.5mk2co3调节ph至7.0。

试剂盒准备：

将nad+和int的混合冻干粉溶于6ml的双蒸水，使用时避光；

将山梨醇脱氢酶冻干粉溶于1ml的双蒸水；

准备不同浓度的标准品溶液，浓度分别为：0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml，0.001mg/ml，0mg/ml(双蒸水)；

取10ml三氯乙酸(tca)加k2co3溶液至ph呈中性，此溶液即为空白样品的空白对照溶液。

样品检测

表10样品测定

2、检测结果

统计学分析：

实验数据以“平均值±标准误”形式表示。使用one-way/two-wayanova进行统计学分析。p<0.05视为有统计学差异。

本实验涉及的原始数据以excel文件格式保存，用graphpadprism(第五版本)分析数据及作图。

图2表示化合物对stz诱导糖尿病大鼠sciatic运动和感觉神经传导损伤的作用*：p<0.05vs模型组。

实验结果表明，在stz诱导糖尿病后大鼠坐骨运动神经与感觉神经的传导速度均降低，提示糖尿病会损伤外周神经。各个给药组能有效地提高受损的神经传导速度，提示各个给药组均能一定程度的对损伤神经起到保护作用。其中与阳性对照药物epalrestat比较，各个化合物对运动神经的保护作用更强，优于阳性对照药物。对感觉神经的保护作用与阳性药物相当。

山梨醇含量的测定结果如表9所示：

表9双侧坐骨神经中的山梨醇含量

one-wayanova,dunnetposthoctest，vscpd-vehicle组***p<0.001。

实验结果表明化合物hw2-2015、hw13-2015和wj-0321-1在降低大鼠双侧坐骨神经中山梨醇含量效果上均优于依帕司他，且化合物hw2-2015显著地降低了发病组大鼠双侧坐骨神经中山梨醇含量。

实施例38：对化合物hw13-2015的安全性评价

为了进一步评价化合物的安全性，我们设计了三组大鼠，分别为500mg/kg、200mg/kg、0mg/kg的三个剂量组，每组6-7只，一共给药28天，进行初步评价化合物hw13-2015的毒性。

配药：

100mg/ml含化合物hw13-2015的悬浮液：取5.12克hw13-2015粉末状固体、10.20克粉末状聚维酮，混合均匀后再加入45.00克水，然后超声5min，整个溶液呈现均匀的乳状悬浮液，无明显颗粒，使用前摇匀。

40mg/ml含化合物hw13-2015的悬浮液：取10.0ml浓度为100mg/ml的hw13-2015悬浮液，再取15.0ml水混合后摇匀即可。

在合成苯并噻二嗪酮衍生物过程中，我们发现苯并噻二嗪酮在水溶液或者酸性水溶液中保持一周对其纯度无影响，所以考虑到药品稳定性问题，hw13-2015的悬浮液我们采取配一次的量仅供使用5天的策略。

给药：灌胃给药

高剂量组500mg/kg，大鼠每次给药浓度为100mg/ml悬浮液1.0ml(大鼠200克)或者1.5ml(大鼠300克)。

低剂量组200mg/kg，大鼠每次给药浓度为40mg/ml悬浮液1.0ml(大鼠200克)或者1.5ml(大鼠300克)。

空白组0mg/kg，不给药也不灌胃。

各组大鼠体重变化见下表。

表11高剂量组大鼠的体重变化

表12低剂量组大鼠的体重变化

表13空白组大鼠的体重变化

图3为各组大鼠体重变化图，更加直观的反应三组大鼠的体重变化。

从图3和表11～13中可以看出，三组大鼠体重变化趋势相似，说明500mg/kg和200mg/kg剂量的化合物hw13-2015对大鼠无毒害作用。

本发明的多个化合物在酶活性测试中，在alr2抑制活性和alr1抑制选择性上均明显优于对照物依帕司他；在高糖环境下对细胞的保护作用，明显优于对照物依帕司他；在药代动力学实验中，化合物在大鼠的体内药物半衰期明显长于依帕司他、在血液中浓度高达依帕司他的30倍；化合物在大鼠体内的有效性实验证实在对stz诱导糖尿病大鼠的坐骨运动神经传导损伤、坐骨感觉神经传导损伤有明显修复作用且效果强于依帕司他，明显加快了感觉神经纤维a-fiber和c-fiber的传导速度且效果优于依帕司他，明显改善降低了大鼠坐骨神经中山梨醇且效果优于依帕司他；在大鼠的安全性评价试验中表现出良好的动物安全性。