一种磷脂酶C活力的检测方法与流程

本发明涉及一种磷脂酶c活力的检测方法。
背景技术：
：磷脂酶c(phospholipasec)简称plc，是一种来源广泛的，作用于磷脂c3位点第一个甘油磷酸酯键的酶。其在油脂精炼中可以将磷脂水解成甘二酯和磷酸基团，提高脱胶效率，有着巨大的应用潜力。目前开发出的plc酶活力检测方法有：卵黄平板法，磷脂酶c水解卵黄卵磷脂，形成甘二酯在平板上形成乳白色沉淀，适合定性检测不适合定量；定磷法，磷酸单酯键水解生成无机磷，通过溶剂萃取，特性反应计算无机磷含量来换算plc酶活，操作繁琐。还有一种酶活测试方法，对底物进行荧光处理，如us2003/219849；pnppc法，底物为荧光脂质，水解后荧光底物结构发生变化从而引起荧光强弱的变化。该法反应灵敏，但是底物设计较为繁琐，且不是plc天然底物，不是对所有类别plc都有效。plc在油脂工业用途主要为脱胶，即在毛油中将磷脂水解为dg和水溶性的磷酰基团，该体系为油水两相体系，而现有的plc酶活测试方法中基本都是在水相体系中进行的，两种体系中底物和酶的分布，酶的活力表现也不尽相同，水相体系磷脂大多溶解状态，而脱胶体系磷脂作为乳化剂包裹在水周围，呈胶体状态，在水相体系测得的酶活不一定能直观的反映磷脂酶在脱胶两相体系的表现，目前缺少一种有效的基于类似脱胶体系的酶活测试方法。技术实现要素：本发明第一方面提供一种检测磷脂酶c活力的方法，所述方法包括：(1)在含有磷脂、甘油、水和底物油脂的反应体系添加所述磷脂酶c，进行反应，生成甘二酯；和(2)将步骤(1)的油相中的甘二酯水解成游离脂肪酸。在一个或多个实施方案中，所述反应体系中，所述磷脂的含量为底物油脂重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％。在一个或多个实施方案中，以底物油脂的重量计，所述磷脂酶c的添加量为0.005～0.1％，例如0.01～0.08％或0.01～0.06％。在一个或多个实施方案中，所述反应体系中，甘油的含量为底物油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％。在一个或多个实施方案中，酶以水溶液的形式添加，酶液和水的总添加量占底物油脂重量的2～6％，例如3～5％。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是毛油或精炼油。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是熔点低于55℃的油脂。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是植物油。在一个或多个实施方案中，所述植物油选自大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。在一个或多个实施方案中，步骤(1)的反应在45～60℃，优选48～55℃的温度下进行。在一个或多个实施方案中，步骤(1)的反应时间为0.5～2h，优选0.5～1h。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括，步骤(1)的反应结束后，将反应混合物的温度升至80～90℃并保持20～40分钟，然后离心获得油相的步骤。在一个或多个实施方案中，所述磷脂酶c为水解产物为甘二酯的磷脂酶c。在一个或多个实施方案中，使用偏甘油酯脂肪酶水解所述甘二酯。在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶来源于青霉属来源的脂肪酶。在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶的添加量为0.0005～0.05mg/ml底物油脂，优选0.001～0.01mg/ml底物油脂。在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶为脂肪酶g50。在一个或多个实施方案中，步骤(2)的反应温度为28～35℃，例如28～33℃。在一个或多个实施方案中，步骤(2)的反应时间为15～45分钟，例如20～35分钟。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括检测游离脂肪酸的步骤。在一个或多个实施方案中，游离脂肪酸含量越高，表明所测的磷脂酶c的酶活越高。在一个或多个实施方案中，所述方法包括：(a)在含有磷脂、甘油、水和底物油脂的反应体系添加磷脂酶c，进行反应，生产甘二酯；(b)将步骤(a)获得的反应混合物离心，获得上层油相；和(c)将偏甘油酯脂肪酶加到步骤(b)的油相中，将该油相中的甘二酯水解成游离脂肪酸。本发明第二方面提供一种组合物，所述组合物含有：磷脂；甘油；水；和底物油脂。在一个或多个实施方案中，所述组合物中磷脂的含量为底物油脂的重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％。在一个或多个实施方案中，所述组合物中甘油的含量为底物油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是毛油或精炼油。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是植物油。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是熔点低于55℃的油脂。在一个或多个实施方案中，所述植物油选自大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。在一个或多个实施方案中，所述组合物还含有磷脂酶c。在一个或多个实施方案中，所述磷脂酶c为水解产物为甘二酯的磷脂酶c。在一个或多个实施方案中，以底物油脂的重量计，所述磷脂酶c的添加量为0.005～0.1％，例如0.01～0.08％或0.01～0.06％。在一个或多个实施方案中，所述组合物中水的含量为底物油脂重量的2～6％，例如3～5％。本发明第三方面提供一种促进磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布的方法，所述方法包括在含有磷脂的油水两相中加入甘油的步骤。在一个或多个实施方案中，以油脂重量计，甘油的添加量为0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％。在一个或多个实施方案中，油水两相中磷脂的含量为油脂重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％。在一个或多个实施方案中，油水两相中水的含量为油脂重量的2～6％，例如3～5％。在一个或多个实施方案中，所述油脂是毛油或精炼油。在一个或多个实施方案中，所述油脂是植物油。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是熔点低于55℃的油脂。在一个或多个实施方案中，所述植物油选自大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。本发明第四方面提供甘油在促进磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布中的应用。在一个或多个实施方案中，以油脂重量计，甘油的使用量为0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％。在一个或多个实施方案中，所述应用为促进含量为油脂重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％的磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布中的应用。在一个或多个实施方案中，所述油水两相中，水的含量为油脂重量的2～6％，例如3～5％。在一个或多个实施方案中，所述油脂是毛油或精炼油。在一个或多个实施方案中，所述油脂是植物油。在一个或多个实施方案中，所述底物油脂是熔点低于55℃的油脂。在一个或多个实施方案中，所述植物油选自大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。附图说明图1：添加不同酶液量的实施例1－6的实验结果。结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。图2：添加不同酶液量的实施例7－12的实验结果。结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。图3：添加不同酶液量的实施例13－18的实验结果。结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。具体实施方式自然条件下的毛油磷脂含量一般在1～5％左右。很少有15％磷脂含量的毛油。毛油中如果磷脂含量较多，会吸水膨胀从而沉淀，造成油中磷脂的分布不均。本发明人意外的发现，在油脂和水形成的油水体系中加入甘油，会提高磷脂在油和水中的均匀分布程度，即使以油脂重量计磷脂含量高达20％，在加入甘油后磷脂也会均匀地分布在油水两相，不会发生吸水沉淀，由此完成本发明。因此，本发明首先提供一种促进磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布的方法，该方法包括在含有磷脂的油水两相中加入甘油的步骤。本发明的磷脂通常为油脂中常见的磷脂种类。本发明中，油脂可以是毛油或精炼油，优选熔点低于55℃的油脂。毛油指未经碱炼、脱色和脱臭的油脂。精炼油可以是经碱炼、脱色和/或脱臭处理的油脂。可使用植物油和动物油。在某些实施方案中，可使用蓖麻油、稻米油、葵花籽油、棕榈油、棕榈仁油、花生油、菜籽油、棉籽油、红花籽油、紫苏籽油、茶籽油、棕榈果油、椰子油、油橄榄油、可可豆油、乌桕籽油、扁桃仁油、杏仁油、油桐籽油、橡胶籽油、玉米胚油、小麦胚油、芝麻籽油、亚麻籽油、月见草籽油、榛子油、胡桃油、葡萄籽油、玻璃苣籽油、沙棘籽油、番茄籽油、南瓜籽油、可可脂、藻油、牛脂、猪油、羊油、鸡脂、鱼油、海豹油、鲸油、海豚油中的一种或两种以上的油脂的任意混合。在某些实施方案中，所述植物油选自大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。通常，水的含量为油脂重量的2～6％，例如3～5％。由此构成的油水两相体系中，通过添加适量的甘油，可将油脂中常见的磷脂在该油水两相体系中的溶解度提高至少10％，例如可达20％。因此，在某些实施方案中，通过添加适量的甘油，可向本发明的油水体系中添加外源磷脂，使得添加后所得混合物中磷脂的含量以油脂重量计可达10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％。通常，该油水两相体系中，甘油的添加量为油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％。本发明因此也包括甘油在促进磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布中的应用。尤其是，本发明使用用量为油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％的甘油促进含量为油脂重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％的磷脂在油脂和水形成的油水两相中均匀分布。优选地，所述油水两相中，水的含量为油脂重量的2～6％，例如3～5％。通过提高磷脂在油水两相中的均匀分布，本发明可利用由此形成的油水两相检测磷脂酶c的酶活。因此，本发明还提供一种反应体系，含有本文所述的磷脂、甘油、水和底物油脂。本发明的反应体系可用于检测磷脂酶c，尤其是水解产物是甘二酯的磷脂酶c的酶活或活力。所述底物油脂为前文所述的毛油或精炼油，例如为植物油油脂，优选为大豆油，葵籽油，橄榄油，玉米油和棕榈油中的一种或者几种的混合物。该反应体系中，磷脂的含量可以是底物油脂的重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％；甘油的含量可以是底物油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％；水的含量可以是底物油脂重量的2～6％，例如3～5％。在某些实施方案中，该反应体系中还含有磷脂酶c。优选地，磷脂酶c可以是任何水解产物为甘二酯的磷脂酶c。通常，以底物油脂的重量计，所述磷脂酶c的添加量为0.005～0.1％，例如0.01～0.08％或0.01～0.06％。该反应体系可以是一均质的组合物或混合物。可采用本领域常规的方法制备该组合物。本发明可利用该反应体系来检测磷脂酶c的酶活(活力)，尤其是磷脂酶c在油脂脱胶中的活力。例如，本发明检测磷脂酶c活力的方法包括：(1)在含有磷脂、甘油、水和底物油脂的反应体系添加磷脂酶c，进行反应，生产甘二酯，和(2)将步骤(1)获得的油相中的甘二酯水解成游离脂肪酸。所述反应体系中，该反应体系中，磷脂的含量可以是底物油脂的重量的10～20％，例如10～15％、15～20％或12～15％；甘油的含量可以是底物油脂重量的0.05～2％，例如0.05～0.5％、0.5～2％或1～1.5％；水的含量可以是底物油脂重量的2～6％，例如3～5％；磷脂酶c的含量为底物油脂重量的0.005～0.1％，例如0.01～0.08％或0.01～0.06％。通常情况下，磷脂酶c可以水溶液的形式提供，也可以纯的磷脂酶c的形式提供。当酶以水溶液的形式提供时，酶液与水的总添加量通常是油脂重量的2～6％，例如3～5％。通常，步骤(1)的反应可在45～60℃，优选48～55℃的温度下进行；反应时间可为0.5～2h，优选0.5～1h。在某些实施方案中，步骤(1)的反应在45～60℃、油相48～55℃的温度下反应结束后，将反应混合物的温度升至80～90℃，保持20～40分钟，然后离心，获得油相。步骤(2)可使用偏甘油酯脂肪酶进行水解。本文中，“偏甘油酯脂肪酶”是指对甘油三酯没有催化水解活力，优先对甘油二酯和/或甘油单酯具有催化水解活力的脂肪酶。偏甘油酯脂肪酶主要有两类：甘油单酯-甘油二酯脂肪酶和甘油单酯脂肪酶。本发明优选使用对甘油单酯和/或甘油二酯具有催化水解活力的偏甘油酯脂肪酶。可使用本领域周知的偏甘油酯脂肪酶，例如，可使用来自曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)和马拉色霉菌属(malassezia)的偏甘油酯脂肪酶。在某些实施方案中，可使用来自沙门柏干酪青霉(penicilliumcamemberti)的偏甘油酯脂肪酶。在某些实施方案中，适用于本发明的偏甘油酯脂肪酶包括但不限于例如cn201410182887.0所公开的偏甘油酯脂肪酶，市售的偏甘油酯脂肪酶如脂肪酶g50(lipaseg"amano"50)，以及脂肪酶gh1(huangj,yangz,guanf等，anovelmono-anddiacylglycerollipasehighlyexpressedinpichiapastoris,anditsapplicationforfoodemulsifierpreparation，processbiochemistry，2013，48(12):1899-1904)、lipasesmg1(xut,lul,hous等，crystalstructureofamono-anddiacylglycerollipasefrommalasseziaglobosa,revealsanovellidconformationandinsightsintothesubstratespecificity，journalofstructuralbiology，2012，178(3):363-9)和脂肪酶repcmdl(tanzb,lijf,lixt等，auniquemono-anddiacylglycerollipasefrompenicilliumcyclopium:heterologousexpression,biochemicalcharacterizationandmolecularbasisforitssubstrateselectivity，plosone，2014，9(7):e102040)等。通常，偏甘油酯脂肪酶的添加量为0.0005～0.05mg/ml底物油脂，优选0.001～0.01mg/ml底物油脂。通常，将偏甘油酯脂肪酶添加到步骤(1)获得的油相中，然后在28～35℃，例如28～33℃反应15～45分钟，例如20～35分钟。之后可离心获得油相，并检测该油相中的ffa含量。因此，在某些实施方案中，本发明的方法还包括检测游离脂肪酸的步骤。可采用本领域常规的方法检测游离脂肪酸含量，例如，可按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。根据本发明的方法，游离脂肪酸含量越高，表明所测的磷脂酶c的酶活越高。通常，在步骤(1)结束后，将所得反应混合物离心，获得上层油相；然后将偏甘油酯脂肪酶加到该油相中，实施步骤(2)以将该油相中的甘三酯水解成游离脂肪酸。在某些实施方案中，本发明的方法包括将磷脂、甘油加到底物油脂中，加热搅拌均匀后，加入磷脂酶c和水，搅拌均匀后使混合物在50℃的温度下反应。反应结束后，可将反应物的温度升至80～90℃，并保持20～40分钟，然后离心，获得油相，加入偏甘油酯脂肪酶反应，离心取上层油相测ffa含量。通常情况下，毛油中如果磷脂含量较多，会吸水膨胀从而沉淀，造成油中磷脂的分布不均，对检测的准确性造成很大影响。而普通的毛油磷脂含量较少，即使全部水解成甘二酯，其ffa变化仅在1％以内，误差更大。而本发明通过在体系中加入甘油，提高磷脂在油和水中的均匀分布程度，使得即使磷脂的添加量高达油脂重量的20％，在加入后磷脂也会均匀的分布在油水两相，不会发生吸水沉淀从而影响方法的准确性。本发明与现有技术相比，采用真实脱胶的油水两相体系而非单一的水相体系，操作简单，实验结果直接，省去复杂的计算，直接反映plc在脱胶中的应用性能。与现有磷脂酶c酶活测试方法相比，反应体系更真实，方法更简便。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用脂肪酶g50为lipaseg"amano"50，是天野酶制品株式会社(amanoenzymeinc.)产品。实施例中所用精炼大豆油购自上海嘉里粮油有限公司，其它常规化学品均购自国药化学试剂有限公司，为分析纯级。实施例中的百分比为重量百分比。酶是以水溶液形式添加。实施例1-6取精炼大豆油30g，加入粉末磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司生产，丙酮不溶物含量98％以上)4.5g，甘油0.015g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表1和图1所示。表1毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％实施例115％0.20.70.64实施例215％0.40.51.22实施例315％0.60.31.90实施例415％0.80.12.46实施例515％1.003.10实施例615％1.203.48对照15％010.04表1及图1的结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。比较例1-6取精炼大豆油30g，加入粉末磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司生产，丙酮不溶物含量98％以上)4.5g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表2所示。表2毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％比较例115％0.20.70.18比较例215％0.40.50.24比较例315％0.60.30.16比较例415％0.80.10.22比较例515％1.000.16比较例615％1.200.20对照15％010.04表2的结果显示，不加甘油，磷脂不能很好的分散在油中被酶接触，所以ffa％和酶添加量没有直接的线性关系。实施例7-12取精炼大豆油30g，加入粉末磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司生产，丙酮不溶物含量98％以上)3g，甘油0.6g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表3和图2所示。表3毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％实施例710％0.21.30.45实施例810％0.41.10.89实施例910％0.60.91.33实施例1010％0.80.71.78实施例1110％1.00.52.22实施例1210％1.20.32.71对照10％01.50.04表3和图2的结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。实施例13-18取精炼大豆油30g，加入粉末磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司生产，丙酮不溶物含量98％以上)6g，甘油0.15g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表4和图3所示。表4毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％实施例1320％0.21.30.71实施例1420％0.41.11.40实施例1520％0.60.92.09实施例1620％0.80.72.80实施例1720％1.00.53.46实施例1820％1.20.34.12对照20％01.50.02表4和图3的结果显示，ffa％和酶液添加量成倍数关系，ffa％能很好的反映磷脂酶活的高低。实施例19-24取精炼大豆油30g，加入粉末磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司生产，丙酮不溶物含量98％以上)1.5g，甘油0.6g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表5所示。表5毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％实施例195％0.21.30.42实施例205％0.41.10.67实施例215％0.60.91.36实施例225％0.80.71.39实施例235％1.00.51.97实施例245％1.20.32.23对照5％01.50.02表5的结果显示，磷脂含量低于10％，达不到酶充分反应所需的量，ffa％和酶的添加量之间也没有规律可循。实施例25-30取大豆油毛油30g，甘油0.6g，加热搅拌至磷脂均匀分散在油中。加入稀释100倍的磷脂酶c(dsm公司生产，plc，蛋白含量15mg/ml)0.2-1.2ml和适量水，均质机(德国fluka)均质30s，然后加热台上50℃反应1h。反应结束升温至85℃，0.5h。将油离心，取20g油转移至100ml三角瓶中，加入amanog50酶(稀释500倍)0.8ml，剧烈震荡后放入30℃水浴0.5h，离心，取上层油相测ffa含量。ffa测定方法按照gb/t5530-2005动植物油脂酸值的测定。结果如下表6所示。表6毛油中丙酮不溶物含量酶液(ml)水(ml)ffa％实施例250.5％0.21.30.20实施例260.5％0.41.10.17实施例270.5％0.60.90.16实施例280.5％0.80.70.29实施例290.5％1.00.50.17实施例300.5％1.20.30.14对照0.5％01.50.02表6的结果显示，天然毛油里磷脂含量较少，即使全部水解成dg，所生成的ffa％也不到1％，所以不能用来做底物油。当前第1页12