miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途的制作方法

本发明涉及一种miRNA的用途，具体涉及miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途。
背景技术：
：癌症一直威胁着人类的健康，目前每年全世界约有700万人死于癌症，其发病隐匿，进展迅速，在出现临床症状或于医院就诊时，往往已经发展到了晚期，大多数患者在确诊后数年内死亡。在欧美发达国家的恶性肿瘤患者5年生存率为60－70％，而中国仅为30.9％，农村生存率更是只有城市的一半。造成肿瘤死亡率如此高的关键因素之一是缺乏早期诊断手段，是病人失去早期治疗的机会。以食管癌为例绝大多数病人就诊时已经处于晚期，错过了最佳治疗时间。而有调查证据表明相对于晚期治疗，早期治疗可使病人的生存率提高3-4倍(以食管癌为例，从20％-30％提高到60-80％)。因此，针对癌症的早期确诊，发现早期无临床症状的病人，将肿瘤患者的治疗窗口提前，改善癌症患者的预后，尤为重要。目前虽然有很多检测技术手段尝试针对癌症进行早期诊断，但针对某些恶性肿瘤仍没有开发出特异性好、检出率高、低成本的能在早期阶段诊断癌症的筛查手段与技术。以我国高发且没有早期诊断和筛查手段的食管癌为例，食管癌是消化系统最常见的肿瘤之一，起病隐匿，我国是食管癌发病率最高的国家，50％的食管癌病人在中国，死亡率位居我国恶性肿瘤的第四位，多数患者在确诊时已有淋巴结转移并进入中晚期，即便马上手术切除病灶，患者的5年生存率仍低于20％，其中75％的患者在确诊后1年内死亡。目前食管癌的筛查或者诊断依赖于影像学和组织病理学检测，前者只能检测到足够大的肿瘤，而后者需要采用食管内镜或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织。不但成本较高，检查效率低，侵入式检查往往使得患者依从性差，无法大批量进行筛查、普查，而且还受到医生的技术水平以及病人的身体状况等诸多因素的影响，不可能用于早期筛查和临床检测。正是由于肿瘤临床面临的这一痛点，因此发现具有高敏感性和特异性的诊治食管癌的生物标记物并建立相关的无创早期检查方法是提高病人生存率的关键，也是这一领域的刚需。目前恶性肿瘤包括食管癌筛查或者诊断主要依赖以解剖结构为基础的影像学检查和组织病理学检测，特别是组织病理学检测需要采用食管内镜或者外科手术从患者上获取肿瘤组织的检材。不但成本较高，检查效率较低，侵入式检查使得患者依从性差，不能反复取材。无法大批量进行筛查、普查，同时还受到医生的技术水平以及病人的身体状况等人为因素的影响，不适合用于早期筛查和临床检测。液态活检技术正好可以解决这一难题，检测分析体液中的分子，可以做到无创和反复取材。虽然液体诊断正在发展，但目前还需要完善。一是液体的种类，二是到底检测什么，另外特别是食管癌的体液诊断仍缺乏一种明确的诊断标志物，且直接从体液如血清、唾液中等提取检测会存在较多非检测物质的影响，这一难题无形之中增加了诊断筛查的难度。现有技术存在以下缺点：1)难以做到恶性肿瘤的早期诊断；2)检测手段通常具有创伤性，给患者带来不适；3)检测结果并不具有足够的敏感性与特异性；4)取材不方便且不易于存放；5)操作的进行对医生要求较高。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种癌症诊断试剂盒，本发明还提供了miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途。为实现上述目的，所采取的技术方案：一种癌症诊断试剂盒，所述癌症诊断试剂盒包括检测miRNA的试剂，所述miRNA包括hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p中的至少一种。优选地，所述检测miRNA的试剂包括检测所述miRNA的探针或者扩增所述miRNA的引物。优选地，所述miRNA来自唾液外泌体。优选地，所述癌症诊断试剂盒包括提取唾液外泌体的试剂、提取唾液外泌体RNA的试剂、RNA反转录试剂以及RNA定量检测试剂。优选地，所述癌症为食管癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、脑胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或头颈部肿瘤。本发明提供了miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途，所述miRNA包括hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p中的至少一种。优选地，所述miRNA来自唾液外泌体。本发明在唾液外泌体中发现了所述miRNA，且与组织具有较高的一致性。优选地，所述癌症为食管癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、脑胶质细胞瘤、胰腺癌、前列腺癌或头颈部肿瘤。本发明提供了检测miRNA的试剂在制备癌症诊断试剂盒中的用途，所述miRNA包括hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p中的至少一种。本发明涉及的液体活检(LiquidBiopsy，也称液态活检)可以弥补传统活检的不足。所谓液体活检指通过简单的体液(目前应用最多的是血液)，对遗传侵入进行定位、研究和监控的检测方法，目前该检测的应用领域正在迅速扩展。液体活检与传统的组织活检相比有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。临床医生可以用它来监测肿瘤对治疗的反应，预测肿瘤复发。从长远角度来看，液体活检还能够帮助医生在患者未出现任何症状的时候发现最初期的肿瘤。比如从血液中游离的DNA片段中取得的基因组信息甚至可以指出体内肿瘤发源的部位。液态活检未来最引人注目的应用领域是在出现癌症症状之前发现癌症。液态活检可比成像检测更早检测出癌症。液体活检是一个新的领域，目前主要是针对血液中的DNA片段和血液中循环肿瘤细胞通过高通量测序检测基因突变。但是这些新的技术有其局限性，本发明涉及的技术在液体活检这一新的领域上进行了升级和创新，建立了全新的液体活检的标志物和技术体系。主要包括：唾液取材、提取外泌体并且检测其中的miRNA,是液体活检这一领域的全新技术。本发明以唾液为标本，主要是利用唾液优于血液和其他体液的特点。唾液是液体诊断的重要组成部分，近年来得到了越来越多的关注，在疾病早期诊断中具有明显的作用。唾液腺血供丰富，唾液被认为是血循环的末端产物，很多血液中的分子物质也见于唾液中。唾液被称为血液的超滤液，比起血液更加纯净，去掉了血液中的很多有型成分。相较其他液体而言，唾液具有易操控，不易凝结，消除了抗凝处理对检验结果的影响。同时，唾液采集具有非侵袭性，受试者基本无痛苦和不适，具有可重复性，安全而廉价。另外，血液中成分复杂，来源多样，信息斑驳，在检测分析的过程中可能会引起非特异性及受到流体动力学作用的干扰。血液中的大量细胞具有数秒至数周或一个月以上的半衰期，也可能对分析结果产生影响。总之，唾液较之其他体液具有较明显的优势。相比较目前使用的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，本发明针对更能代表肿瘤特性的miRNA。miRNA是具有在转录后水平调控基因表达功能的非编码小分子RNA，长度约18-24nt,参与细胞分裂增殖、分化与发育，以及代谢等许多重要的生物过程,在生物种属之间具有高度的保守性、时序性以及组织特异性。它位于基因内含子中，成熟的miRNA进入RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称性复合物。RISC中成熟的miRNA链可与其靶mRNA3’非翻译区特异性结合，从而降解靶mRNA，阻断蛋白合成，调控基因的表达。miRNA作为一种在某些肿瘤中异常表达的非编码的小RNA，参与许多肿瘤的发生发展的相关基因的调控，在这一过程中发挥着十分关键的作用，且其即使在大量核酶存在的情况下依旧十分稳定，在各种体液中表达丰富，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。本发明采用从外泌体中提取miRNA的技术，能够更好地得到稳定的miRNA。本发明针对临床上的刚需和痛点，主要解决目前临床使用的以解剖结构为基础的传统影像和病理存在的问题和瓶颈。另外目前市场上液态活检技术刚刚兴起，还有不少缺点和瓶颈，本发明解决了这些缺点和问题。首先如前所述，目前肿瘤的筛查或者诊断主要依赖于影像学和组织病理学检测，前者只能检测到足够大的肿瘤，而后者需要采用食管内镜或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织。不但成本较高，检查效率低，侵入式检查往往使得患者依从性差。肿瘤组织中存在一定的异质性，组织病理检测可能会造成诊断结果的偏倚，这种技术只能对单一器官进行检测，局限性也非常大，不适合在常规体检时使用，这些手段难以进行重复活检和动态检测。所以上述技术不可能用于早期筛查和临床检测。而本发明所涉及的技术是一种无创液体活检技术，可以很好地解决上述困难。液态活检是分子诊断在样本来源上的延伸，它一方面可以大幅缩短癌症确认时间，在癌症早期就能够进行确认；另一方面，液态活检可以检测肿瘤类型多，检测方便，可以对癌症患者的治疗情况进行随时跟踪，真正实现“个性化精准治疗其次，目前的液体活检主要是针对血液中的CTC，ctDNA。CTC是实体瘤释放到外周血中的循环肿瘤细胞，ctDNA是肿瘤细胞释放到外周血中的DNA，二者虽有一定优势，但是这两种检测基因突变的方法都存在缺陷和瓶颈。ctDNA偏前端，主要用于癌症早期筛查，个性化用药指导和耐药性分析，但其在血浆中含量有限(10～20ng/ml)，如何有效的富集仍是相关分析的最关键步骤和难点，另外ctDNA也存在标准难以统一；CTC偏后端，主要用于癌症的实时监测，判断预后等，但也有很多问题。比如如何区分上皮间质转化(EMT)是处理过程中亟待解决的技术问题。另外目前检测方法只能找到部分肿瘤细胞，起不到指导个体化用药的目的；循环肿瘤细胞有很多个个分型，目前检测方法只能检测到很少几个分型，漏检率高。每次检测费太高，没有进入医保目录，而且要需要多次检测比对结果。本发明中的miRNA具有比DNA更稳定，并更能反映肿瘤细胞的内在生物信息(请查，扩大此处的优点)，并且检测方便，一次采样可以检测多个标志物，可以定量，便于统一标准，另外本发明是通过高通量筛查出的一组miRNA,可以通过组合来更全面准确地反映肿瘤细胞的细微变化。第三,目前除了检测血液CTC和ctDNA外，也有检测血液miRNA等，但是这种直接检测裸露的DNA和RNA都会造成不同程度的损失和降解。本发明应用外泌体(exsome)可以保护RNA不被降解。外泌体(exosome)是一种直径仅为30-100nm纳米级的双层脂质膜所包围的囊泡小体，，可由B细胞、T细胞、树突细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等机体内多种细胞分泌释放，天然存在于体液中，在血液、唾液、尿液、腹水和母乳等中具有较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分，参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态,并与多种疾病的发生与进程密切相关。肿瘤细胞在生长过程中会不断分泌外泌体，从而进入淋巴系统和肿瘤组织内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤抑制或促进的双重调控作用等作用。外泌体携带的信息多样化，其中的蛋白质和核酸，均可用于癌症的早诊、复发监测、抗药性监测等相关方面的分析。而且外泌体更易富集,在数量上多于目前发展的CTC；而且在外泌体的分泌囊泡能够有效保护核酸类物质不被核酸酶分解，克服了ctDNA在血液中容易降解的问题，在临床应用上大有可为；且外泌体更为稳定，即便是-70℃保存30年的血液也可以从中提取外泌体。目前，已有越来越多的学者开始关注外泌体在肿瘤发生和发展中的作用及其机制。外泌体中含有丰富的miRNA,因此检测外泌体源性的miRNA有助于肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。第四，液体活检到底检测什么液体？这一问题越来越引起注意。目前常用的血液有型成分复杂，很多细胞和因子干扰肿瘤细胞或ctDNA的信息。而本发明用的唾液作为液体诊断的重要组成部分，近年来得到了越来越多的关注，在疾病早期诊断中具有明显的作用。唾液腺血供丰富，唾液被认为是血循环的末端产物，很多血液中的分子物质也见于唾液中。唾液相较其他液体而言，具有易操控，不易凝结，消除了抗凝处理对检验结果的影响。同时，唾液采集具有非侵袭性，受试者基本无痛苦和不适，具有可重复性，安全而廉价。血液样本尽管包含了全身状况的众多信息，但血液采集具有侵袭性，引起患者不适。另外，血液中成分复杂，来源多样，信息斑驳，在检测分析的过程中可能会引起非特异性及受到流体动力学作用的干扰。血液中的大量细胞具有数秒至数周或一个月以上的半衰期，也可能对分析结果产生影响，因此，唾液较血液具有较明显的优势。本发明的有益效果在于：一、首先，本发明采用病人严格入组和评估，通过基因芯片高通量筛查食管癌患者与正常志愿者的外泌体中miRNA的表达差异，发现了hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在食管癌中显著上调，且与组织具有较高的一致性，并应用了Q-PCR进行了大样本的验证。因此，本发明所提供的hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p具有严谨的科学基础与良好的科学意义，保证了hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p作为食管癌标志物和诊断试剂盒的应用的科学性与普适性,且这些分子标记物中的一种或者多种的组合提高了检测的敏感性以及特异性，。二、目前液体活检正在不断发展中，体液中肿瘤源性外泌体来源的miRNA是一种新兴的生物诊断标志物，由此开发的诊断食管癌的试剂盒，是一种具有非侵袭性、高敏感性高特异性、适用于普查筛查大样本调查的液体诊断监控技术。三、通过检测肿瘤源性外泌体来源的miRNA的表达，提供一种能够利用体液等生物样本进行食管肿瘤诊断的，稳定性高、定量精确的试剂盒和系统，并由于其微创，易于检测，便于反复多次取样，有助于实时反映动态检测食管癌患者的疾病状态，有助于临床医生迅速掌握患者病情，从而及时制定更具有个体化的治疗措施。附图说明图1为本发明实施例1中hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在食管癌与正常人外泌体中表达水平对比图；图2为本发明实施例1中hsa-miR-642a-3p的敏感性和特异性分析结果；图3为本发明实施例1中组织中hsa-miR-642a-3p与其对应的唾液外泌体的相关性分析结果。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。在本发明中，除特别定义外，浓度单位均为每升溶液的摩尔浓度。本领域技术人员进一步知悉，本发明下述实施例中的各个浓度，摩尔分数，质量分数均可以根据实际进行进行调整。本领域技术人员可以实现上述调整。实施例1：通过检测唾液中miRNA的RNA含量，对于食管癌患者进行诊断。实施步骤1：唾液的收集、保存以及运输1、收集：于早晨8-10点，采用非刺激性滴取法于安静舒适的环境下，对满足下列条件受试者进行全唾液收集：1.空腹，未进行剧烈运动；2.嘱咐受试者用约20-60ml左右漱口液，以清除口腔内食物等残渣，吐尽残留液体，头部微下垂，静坐后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于收集皿中，以唾液铺满培养皿为宜，约250-900ul，而后迅速分装至无菌保存管。2、保存：采集的唾液在保存管离心后，冰冻状态可长期保存。3、运输：如需运输，可置于运输盒进行运输，可以保证后续实验免受受唾液中各种微生物或酶的影响。发明人多年来在国内多家医院收集大量肿瘤患者和正常人用于外泌体检测的唾液样本(均按上述标准进行收集、保存及运输)。实施步骤2：唾液外泌体提取取等体积实验步骤1所得唾液如500uL(所需唾液量至少可为250ul).(未进行离心处理的唾液)，2500-5000g/分钟离心15min。用移液器将离心所得上清移至新的1.5ML的EP管中，约450-470uL澄清上清，加入等量的外泌体沉淀溶液混匀,4℃静置孵育过夜，10000g4℃离心1h后弃上清，收集沉淀，将外泌体白色沉淀物用适量1X外泌体悬浮液重悬得到外泌体重悬液。根据Nanosight分析外泌体相应数量如表1所示。表1外泌体数量实施步骤3：唾液外泌体中RNA提取在上述实施步骤2中最后得到的外泌体白色沉淀中，加入250-500ul的RNA提取液，反复吹打后，室温裂解7-14min，混合均匀后加入相应miRNA的外参cel-miR-39用以后续分析标准化。加入60ul的RNA除杂液，涡旋充分混匀后，室温静置4-14min，离心10000-13000g4-14min，转上层水相到另一个新管，加入等体积的RNA沉淀液，上下颠倒混匀后室温静置4-14min，或者-20℃沉淀。离心10000-13000g4-14min后，弃去上清液，加入250-500ul-20℃预冷的RNA洗涤液洗涤沉淀，震荡混匀，12000g/5min，弃乙醇液体，超净台静置充分晾干沉淀。所得沉淀用RNA富集液溶解沉淀运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测纯度及浓度，所得RNA封口膜密封，-80摄氏度保存。运用NanoDorp2000紫外分光光度计检测分析得到如表2：表2唾液外泌体中RNA的浓度发明人按照上述步骤提取所收集的唾液外泌体中的RNA，根据总RNA浓度，送检适量体积的RNA进行microRNA芯片筛选，实验涉及10例汕头大学附属肿瘤医院食管癌患者以及10例汕头市老年大学正常志愿者的唾液。严格控制两组之间的年龄、男女差异，有无吸烟等其他因素。miRNA芯片(AgilentHumanmiRNA(8*60K)array)由上海伯豪生物技术有限公司分析完成。芯片筛选结果发现hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在食管癌患者肿瘤源性的外泌体来源的表达明显高于正常人。芯片筛选结果如表3所示，表3示出了本发明中唾液外泌体miRNA进行芯片筛选的结果，其中hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在癌症里较正常表达高。涉及的序列具体如下：hsa-miR-642a-3p(MIMAT0020924)：AGACACAUUUGGAGAGGGAACC(SEQIDNO:1)hsa-miR-3135b(MIMAT0018985)：GGCUGGAGCGAGUGCAGUGGUG(SEQIDNO:2)hsa-miR-1972(MIMAT0009447)：UCAGGCCAGGCACAGUGGCUCA(SEQIDNO:3)hsa-miR-6893-5p(MIMAT0027686)：CAGGCAGGUGUAGGGUGGAGC(SEQIDNO:4)。表3芯片筛选结果SystematicNamepvaluesFoldChangehsa-miR-3135b0.0034223964.896762357hsa-miR-19720.0045525214.125896647hsa-miR-642a-3p0.0041425253.092007573hsa-miR-6893-5p0.0129980832.159275748上述所述试剂成分如表4示：表4试剂成分表试剂名称主要成分外泌体沉淀溶液聚乙二醇6000外泌体悬浮液磷酸缓冲盐溶液RNA提取液苯酚以及RNA酶抑制剂RNA除杂液氯仿等RNA沉淀液异丙醇等RNA洗涤液75％DEPC乙醇RNA富集液DEPC水溶液实施步骤4：唾液外泌体中miRNA反转录使用加尾法、茎环法将miRNA反转录成cDNA，采用市面上已成熟的试剂盒如复能公司的All-in-OneTMmiRNAqRT-PCRDetection(QP015、QP016)，按照说明书操作，具体如表5所示：表5反转录体系成份剂量5*miRNA反转录缓冲液5ulmiRNARTase混合液1ulmiRNApolyA多聚酶1ul总RNA1ng-5ugDEPC水补足至25ul混合均匀后，简单离心置于PCR仪，37℃1h,85℃5min,所得产物cDNA置于-80℃冰箱备用。实验步骤5：Q-PCR验证hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p对食管癌发病的诊断使用SYBRGREEN法或者探针法对miRNA反转录所得cDNA进行检测，采用市面上已成熟的试剂盒如复能公司的All-in-OneTMmiRNAqRT-PCRDetection(QP015、QP016)，按照说明书操作，以表6所示的比例配成20uLRealTimePCR反应体系：表6RealTimePCR反应体系成份剂量2*SYBRGREEN缓冲液10ulmiRNASYBRGREEN通用反向引物2ulmiRNASYBRGREEN正向引物2ulcDNA模板2ulROX试剂0.1ulddH2O3.9ul使用AppliedBiosystems7500RealTimePCRSystem进行实时荧光定量PCR检测，△△CT法进行相对定量。RealTimePCR反应条件为95℃10min,(95℃10s60℃20s72℃10s)*40个循环。所用正向特异性引物购自复能基因,分别为：hsa-miR-642a-3pHmiRQP3010hsa-miR-3135bHmiRQP2093hsa-miR-1972HmiRQP1325hsa-miR-6893-5pHmiRQP3882cel-miR-39cel-miR-39-3P。选用汕头大学附属肿瘤医院100例食管癌患者唾液以及汕头市老年大学的40例正常人唾液对筛选出的hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p进行PCR验证，△△CT法进行相对定量，由图1可见，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在食管癌与正常人外泌体中表达差异较大，图1示出了对芯片筛选的miRNA进行PCR验证，hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-3135b、hsa-miR-1972以及hsa-miR-6893-5p在食管癌的表达水平较正常食管的高(样本例数n＝100,***表示统计学差异p<0.001)，能较好对食管癌进行诊断。图2示出了以hsa-miR-642a-3p为例运用ROC曲线对其敏感性、特异性进行分析，说明其对食管癌的诊断筛查具有临床应用意义，利用ROC曲线分析显示，其中的miR-642a-3p在区分食管癌与正常人时，AUC值为0.952，cutoff点敏感性为0.773，特异性为1。图3示出了食管癌患者癌组织中hsa-miR-642a-3p与唾液外泌体中hsa-miR-642a-3p的相关性分析，说明唾液外泌体的hsa-miR-642a-3p与癌组织有较好的一致性，能够反映癌组织的表达水平。由此可见，筛选出的外泌体中的miRNA在食管癌与正常人中表达差异较大，能较好对食管癌进行诊断。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>汕头大学<120>miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>RNA<213>智人（Homosapiens）<400>1agacacauuuggagagggaacc22<210>2<211>22<212>RNA<213>智人（Homosapiens）<400>2ggcuggagcgagugcaguggug22<210>3<211>22<212>RNA<213>智人（Homosapiens）<400>3ucaggccaggcacaguggcuca22<210>4<211>21<212>RNA<213>智人（Homosapiens）<400>4caggcagguguaggguggagc21当前第1页1 2 3