一种引物组及其制备的试剂盒和应用的制作方法

本发明涉及生物学检测技术领域，特别是涉及一种引物组及其制备的试剂盒和应用，用于检测大肠杆菌o103、o111、o145血清型。

背景技术：

大肠杆菌又称大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，1885年首次被发现，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。致病性大肠杆菌(pathogenicescherichiacoli)主要引起急性腹泻，所以又称致腹泻性大肠杆菌。根据o抗原分型，致病性大肠杆菌约有60个血清型，按发病机制可将其分为5类：①肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenice.coli，etec)；②肠致病性大肠杆菌(enteropathogenice.coli，epec)；③肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasivee.coli，eiec)；④肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagice.coli，ehec)；⑤肠黏附性大肠杆菌(enteroadherente.coli，eaec)。致病性大肠杆菌感染主要经粪口途径传播。在世界各地广泛存在，可呈散发或暴发流行，也曾引起院内感染的暴发流行。

大肠杆菌o157:h7是大肠杆菌的其中一个类型，该种病菌常见于牛只等温血动物的肠内。这一型的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状。o157:h7引起的出血性结肠炎是1982年在美国俄勒岗州和密执安州，因食用汉堡包引起的食物中毒的病人粪便中被分离并命名的。据美国疾病控制中心(cdc)报告，每年全国约发现2万多例病人。死亡人数200-500人，以后陆续在全球五大州20多个国家被发现或引起暴发和流行。我国1988年首次分离到e.colio157:h7。从已有的流行病学调查资料看，我国也存在散发病例，还没有爆发流行的报道。近几年也通过监测，先后从牛、猪、羊、粪便，肉类等食品中查到e.colio157:h7。近年来，产毒素而非o157的大肠杆菌，严重威胁人类的健康，越来越受到世界各国的关注。据统计，在美国由non-o157stec引起的患病病例中，有71％是由o26、o45、o103、o111、o121、o145血清型引起的。为了保障人类的健康和牛肉市场的正常供应，2011年9月，美国农业部颁布了一项禁止出售带有大肠杆菌“thebigsix”(o26、o45、o103、o111、o121、o145)牛肉制品的法令。

大肠杆菌表面抗原o-抗原是刺激机体产生先天性免疫和获得性免疫的重要毒力因子，在大肠杆菌的致病性过程中起着重要的作用。针对于o抗原的传统血凝试验是检测血清型的主要方法，该方法费时、费力，pcr检测技术在大肠杆菌血清型检测过程得到发展和应用，目前，针对o103、o111、o145血清型多重pcr检测方法还未见报道，因此，研究一种适用于不同检测平台的多重pcr检测方法应用于o103、o111、o145血清型的检测方法并组装成试剂盒，同时具备特异、敏感、省时、省力的优点，是本发明需要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种引物组及其制备的试剂盒和应用。本发明的试剂盒对引物组能在同一反应体系能进行有效扩增。实验表明，本发明所述含该引物组的检测试剂盒具有特异、敏感、快速和操作简单的特点，能较好的丰富当前大肠杆菌o103、o111、o145血清分型检测技术，可以满足当前大肠杆菌o103、o111、o145血清型分型的快速检测需求，易于推广应用，适用于食品和生物领域中3种血清型大肠杆菌的初筛选，具有广阔的市场应用前景。

本发明的一种引物组及其制备的试剂盒和应用技术方案为：一种引物组，包括以下引物序列，其核苷酸序列分别为：

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'。

大肠杆菌o103血清型特异性引物扩增的目的片段大小为：327bp；

大肠杆菌o111血清型特异性引物扩增的目的片段大小为：444bp；

大肠杆菌o145血清型特异性引物扩增的目的片段大小为：756bp。

一种试剂盒，包含权利要求1所述的引物组合物。

该试剂盒还含有商品化的2×pcr反应液。

上述的引物组，或者上述的试剂盒，在大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测中的用途。

一种大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测方法，使用如权利要求2所述的试剂盒，包括以下步骤：将待测大肠杆菌菌液或待测大肠杆菌的dna提取物作为模板，用所述引物组进行pcr扩增，对扩增产物进行检测，大肠杆菌o103血清型电泳结果出现327bp条带；大肠杆菌o111血清型出现444bp条带；大肠杆菌o145血清型出现756bp条带。

pcr反应体系为50μl时含有：2×pcrbuffer25μl、各引物浓度为5μm引物的混合液5μl、模板3μl、超纯水17μl。

pcr参数：95℃预变性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32个循环；72℃6min。

所述的一种大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测方法，包括以下步骤：

(1)大肠杆菌模板的制备

将待测大肠杆菌菌株菌液接种至lb液体培养基，37℃过夜摇菌，取1ml菌液，分别用煮沸法和商品化细菌基因组提取试剂盒，进行模板制备；

(2)特异性引物的制备o抗原特异性引物o103上游、o103下游、o111上游、o111下游、o145上游和o145下游的使用浓度为5μm；引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；

(3)pcr反应体系的建立和扩增

取灭菌处理pcr反应管，分别加2×pcr反应混合液25μl、引物o103上游、o103下游、o111上游、o111下游、o145上游和o145下游引物组混合液5μl、模板3.0μl、超纯水17.0μl，混匀；pcr反应参数：95℃预变性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32个循环；72℃6min；

(4)pcr检测结果判定

取8μlpcr产物，点样于1.2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120v电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，具体判定方法：电泳结果出现327bp条带为大肠杆菌o103血清型；出现444bp条带为大肠杆菌o111血清型；出现756bp条带为大肠杆菌o145血清型。

本发明的有益效果为：血清凝集试验是传统的大肠杆菌检测技术，缺点是费时费力、交叉反应严重，敏感性低。本发明基于大肠杆菌o抗原基因血清型特异性基因区段，设计可以在同一检测体系进行以o103、o111、o145血清型大肠杆菌o抗原基因的特异性引物，采用聚合酶链反应(pcr)判定该菌大肠杆菌的血清型。所述检测试剂盒及其检测方法具有特异、敏感、快速、成本低和操作简单的特点，能较好的弥补当前大肠杆菌血清型检测方法上的不足，易于大范围推广应用，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1所示为实施例2大肠杆菌o103、o111、o145血清型pcr检测电泳图；

图2所示为实施例3大肠杆菌o103、o111、o145血清型pcr检测试剂盒特异性检测电泳图；

图3所示为实施例3以大肠杆菌培养物为模板的pcr检测试剂盒灵敏度检测电泳图；

图4所示为实施例3以大肠杆菌基因组dna为模板的pcr检测试剂盒灵敏度检测电泳图。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测引物组的设计

一种引物组，其核苷酸序列分别为：

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'；

设计的3对血清型特异性引物。根据设计的引物组分别扩增327bp、444bp和756bp的o103、o111、o145血清型特异性目的片段。

实施例2

大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测试剂盒的制备

(1)大肠杆菌模板的制备

调取大肠杆菌菌单菌落接种至lb液体培养基，37℃增菌过夜。各取1ml菌液，制成模板备用。

(2)特异性引物的制备

本试剂盒检测的大肠杆菌o103、o111、o145血清型特异性引物扩增的目的片段大小分别为：327bp(o103)、444bp(o111)和756bp(o145)。各条引物使用浓度为5μm，引物稀释液置于-20℃保存备用，避免反复冻融；可根据如下引物序列人工合成。

o103上游:5'-tgattggagcgttaactggacct-3',

o103下游:5'-aaagctcccgagcacgtataaag-3'；

o111上游:5'-atttgtttcttcgatgttgcgag-3',

o111下游:5'-aaggcaagggacataagaagcca-3'；

o145上游:5'-attttcattgttttgcttgctcg-3',

o145下游:5'-caaggcaagctttggaaatgaaa-3'；

(3)pcr反应体系的建立和扩增

取灭菌处理pcr反应管，分别加2×pcr反应混合液25μl、引物o103-上游、o103-下游、o111-上游、o111-下游、o145-上游和o145-下游引物组混合液5μl、模板3.0μl、超纯水17.0μl，混匀；pcr反应参数：95℃预变性10min；95℃45s，57℃1min，72℃1min，32个循环；72℃6min

(4)pcr检测结果判定

取8μlpcr扩增产物，点样于1.2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，120v电压，电泳20min，于凝胶成像系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现。

具体判定方法：电泳结果出现327bp条带为大肠杆菌o103血清型(说明书附图图1第1泳道)；出现444bp条带为大肠杆菌o111血清型(说明书附图图1第2泳道)；出现756bp条带为大肠杆菌o145血清型(说明书附图图1第3泳道)。

实施例3

大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测试剂盒的特异性和敏感性评价

本实施例中对实施例2中制备的大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测试剂盒特异性、敏感性和重复性等主要特征分别进行了测评。

(1)试剂盒特异性试验

选取大肠杆菌o26、o45、o121、o103、o145、o113、o111、o157、o78、o101、鼠伤寒沙门氏菌(cvcc3384)、肠炎沙门氏菌(cvcc1805)、鸡白痢沙门氏菌(cvcc519)、鸭沙门氏菌(cau0118)、禽巴氏杆菌(cvcc493)、鸡毒支原体(cvcc1651)、禽支原体(cvcc274)、金黄色葡萄球菌(cvcc543)、禽波氏菌(atcc菌株ipdh591-77)、猪2型链球菌。按照试剂盒使用说明操作进行pcr，产物于1.2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。大肠杆菌o103、o111、o145可扩增到特异性条带，其它菌株的pcr结果均为阴性(如说明书附图图2)，泳道1-20分别为：o103、o111、o145、o26、o121、o113、o45、o157、o78、o101、鼠伤寒沙门氏菌(cvcc3384)、肠炎沙门氏菌(cvcc1805)、鸡白痢沙门氏菌(cvcc519)、鸭沙门氏菌(cau0118)、禽巴氏杆菌(cvcc493)、鸡毒支原体(cvcc1651)、禽支原体(cvcc274)、金黄色葡萄球菌(cvcc543)、禽波氏菌(atcc菌株ipdh591-77)、猪2型链球菌。

(2)以细菌培养物为模板的试剂盒灵敏度试验

分别接种大肠杆菌o103、o111、o145单菌落至lb液体培养基中，37℃增菌过夜，各取1ml菌液，分别制备菌液，浓度为10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml、10³cfu/ml、10²cfu/ml、10cfu/ml、1cfu/ml。各吸取3μl加入pcr反应体系，按照试剂盒操作说明进行pcr，根据试验结果测定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测方法可以检测出100cfu的o103和o145血清型大肠杆菌，能检测出10cfu的o111血清型大肠杆菌(如说明书附图图3)。

(3)以细菌基因组dna为模板的试剂盒灵敏度试验

分别接种大肠杆菌o103、o111、o145单菌落至lb液体培养基中，37℃增菌过夜，各取1ml菌液提取细菌基因组dna，分别稀释浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、500pg/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl。各吸取3μl加入pcr反应体系，按照试剂盒操作说明进行pcr，根据试验结果确定试剂盒的灵敏度。结果表明，本发明建立的大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测方法可以检测出10pg的o103、o111、o145血清型大肠杆菌(如说明书附图图4)

通过条件优化，确定了最佳的pcr反应体系和反应参数，组装了大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测试剂盒。对大肠杆菌o103、o111、o145的阳性菌株进行扩增，均可进行特异性检测，而其他细菌标准菌株等对照样品均未有扩增，说明该试剂盒具有很好的特异性。灵敏性检测表明，试剂盒具有较高的灵敏的性，其最低检测灵敏度可达到10cfu细菌菌液及10pg细菌基因组dna。研究结果表明，本发明的大肠杆菌o103、o111、o145血清型检测试剂盒具有灵敏、特异、快速的优点，为大肠杆菌o103、o111、o145血清型快速检测及流行病学调查提供了新的技术和物质保障。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>山东省滨州畜牧兽医研究院

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