一种海带雄配子体特异分子标记及其应用的制作方法

本发明属于藻类分子遗传育种领域，具体涉及一种海带雄配子体特异分子标记及其应用。

背景技术：

海带(Saccharina japonica)是我国人工栽培历史最长、产量最高、养殖面积最广的大型经济海藻。海带具典型的异型世代交替生活史，由大型的孢子体世代与微小的配子体世代相互交替而组成。孢子体个体大，是人工栽培和商品生产对象，占生活史时间长。配子体为微小丝状体，是人工培育苗种的对象，在生活史中一般只存在两个星期左右。

海带配子体克隆技术在我国建立于二十世纪六、七十年代。通过海带雌、雄配子体人工分离，同时给予一定的外部培养环境条件，配子体可以只进行营养生长而不发育产精产卵，最终海带配子体可形成无性繁殖系，并可在低温、弱光下长期活体保存。配子体克隆的培育成功，使得在学术上短命的配子体在人工条件下转化为长寿，实现配子体无限繁殖，因此，配子体克隆已经成为海带种质资源保存和利用对象。同时，基于海带配子体克隆技术建立的海带配子体克隆育苗技术也在生产生得到大规模应用，如海带新品种“东方2号”的培育就是通过海带配子体克隆育苗技术获得的。目前，海带配子体克隆在海带保种、育种、育苗、生理及遗传学研究中发挥着越来越重要的作用。

然而在实际的海带配子体保种以及苗种培育过程中，通常会面临雌雄配子体混淆的情况。如在海带配子体保种过程中，需要对种质库中保存的海带配子体克隆定期更换培养液，由于保存的海带配子体呈现为丝状或单细胞游离形式，在保存换水过程中常常导致不同性别的海带配子体克隆混淆。因此，在进行海带配子体克隆育苗以及研究孤雌生殖等单性育种实验中，目前无法验证得到的孢子体是由通过单个配子体单性生殖得到的还是由雌、雄配子体杂交得到的。以上这些问题限制了海带配子体在种质保存、育苗以及相关遗传学研究的应用。

因此，鉴定海带配子体性别及单性生殖海带孢子体还需要一种针对性更强、筛选方法效率更高、鉴定效果更准确的性别快速鉴定分子技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种海带雄配子体特异分子标记及其应用，从而可以有效的鉴定海带配子体性别，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种海带雄配子体特异性分子标记，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明另一个方面提供一种检测海带配子体性别或单性生殖的孤雌生殖孢子体的制品，该制品能够检测上述的特异性片段；

所述的制品，为PCR扩增引物对或分子探针；

作为实施例的一种具体记载，所述的扩增引物对的上下游引物的序列信息如下

上游引物：5’-CGGAGATGCAGGTTCTAAGC-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：5’-CGCCACCCAAAAGGTTTAC-3’(SEQ ID NO:4)；

本发明再一个发明提供一种检测海带配子体性别的方法，是通过检测上述的特异性片段来完成的；其步骤包括待检测的海带配子体基因组DNA的提取、PCR扩增、扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测。其特征为雄性个体中扩增出一种大小为448bp的DNA片段，在雌性个体中无特异性扩增产物。

本发明筛选获得的海带配子体性别特异DNA片段，可用于设计引物，从而快速、准确鉴定海带配子体性别。筛选的性别鉴定标记引物序列来自海带基因编码序列，针对性更强，效率更高，准确度更高；利用海带基因组DNA为模板进行常规PCR扩增，扩增出的雄性特异性目的条带可用琼脂糖凝胶电泳显示，鉴定过程简单快捷。本发明所示鉴定海带配子体性别的方法，还可用于鉴定单性生殖的孤雌生殖孢子体，为推动海带配子体的育种应用研究以及海带性别决定进化系统的研究具有重要意义。

附图说明

图1：本发明在海带雌雄配子体性别鉴定中琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DL2000；♀为雌配子体，♂为雄配子体；

图2：本发明在单性繁殖海带孢子体鉴定中琼脂糖凝胶电泳图，其中M为Marker III；SP为两性繁殖孢子体，pSP为孤雌生殖孢子体。

具体实施方式

海带生活史为二倍性孢子体和单倍性配子体世代交替。其中二倍体孢子体个体无性别之分，单倍体配子体有雌雄性别之分。配子体由孢子体成熟后放散游孢子发育而来的微型丝状体。以下实验所用配子体克隆为实验室保存的海带配子体克隆繁殖繁殖系。海带雌、雄配子体发育分别产生精子和卵。精子与卵受精结合产生合子，并发育成的孢子体为两性繁殖孢子体。海带雌配子体在一定条件下能进行孤雌生殖，获得能发育成性成熟的孢子体。该孢子体与两性繁殖孢子体表型上相似，称为孤雌生殖孢子体。通过对海带转录组和海带基因组进行生物信息学分析，发现了一条海带基因组DNA片段为海带雄配子体特异分子标记，从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1海带雄配子体特异标记筛选

海带全基因组DNA序列从NCBI数据库中获得，海带转录组mRNA编码序列来源于本实验室转录组测序结果拼接序列。通过生物信息学分析获得一条海带转录组RNA片段(SEQ ID NO:1)及与之对应的一条海带基因组DNA片段(SEQ ID NO:2)为海带雄配子体特异分子标记。

实施例2：检测引物的设计

根据上述DNA片段(SEQ ID NO:2)设计了多对引物，每对引物正向和反向引物分别位于非编码序列上下游，从中筛选出了结果稳定的一对引物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4)。

上游引物：5’-CGGAGATGCAGGTTCTAAGC-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物：5’-CGCCACCCAAAAGGTTTAC-3’(SEQ ID NO:4)；

选择实验室保存的已知性别的雌雄配子体克隆各5个，采用商品化的常规植物基因组DNA提取试剂盒提取海带配子体基因组DNA。使用引物SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4进行PCR扩增。反应条件及程序如下：

PCR反应体系包括10.5μL ddH₂O，1.5μL 10×Buffer，0.6μL dNTP(2.5mmol/L)，0.6μL SEQ ID NO:3，0.6μL SEQ ID NO:4，0.2μL rTaq酶(5U/μL)，1μL模板DNA(50ng/μL)。PCR扩增程序：95℃10min；95℃45s、60℃45s、72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳可以看出雄配子体DNA可扩增出448bp特异条带，雌配子体DNA无特异条带扩增，结果如图1所示；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳可以看出雄配子体DNA可扩增出448bp特异条带，雌配子体DNA无特异条带扩增。

实施例3海带雄配子体特异标记在鉴定单性生殖海带孢子体中的应用

选取已知两性繁殖海带孢子体以及孤雌生殖海带孢子体各3株，取其幼嫩期叶片，用消毒海水洗净后提取海带孢子体基因组DNA。使用海带雄配子体特异标记引物对孢子体基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系包括10.5μL ddH₂O，1.5μL 10×Buffer，0.6μL dNTP(2.5mmol/L)，0.6μL SEQ ID NO:3，0.6μL SEQ ID NO:4，0.2μL rTaq酶(5U/μL)，1μL模板DNA(50ng/μL)。PCR扩增程序：95℃10min；95℃45s、60℃45s、72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳可以看出两性繁殖海带孢子体DNA可扩增出448bp的DNA特异条带，孤雌生殖海带孢子体DNA无特异条带扩增，结果如图2所示；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳可以看出两性繁殖海带孢子体DNA可扩增出448bp特异条带，孤雌生殖海带孢子体DNA无特异条带扩增。

上述结果表明本发明所提供的海带配子体性别特异DNA片段可以用来快速、准确鉴定的海带配子体性别。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 一种海带雄配子体特异分子标记及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 240

<212> RNA

<213> 1

<400> 1

tgtggcccat gcgtccaggg aagttgcggt tggtggtgga cacgcattga aacggttcgt 60

tcatgcgtgc gtacgtatcg gccggccctc caaggcacgc agcgcacgac ggagatgcag 120

gttctaagca gccagcctcg cgaaaaattg aagccagcgt gcgcccttcg atcttcaagg 180

tctggatgtc gttgtaaacc ttttgggtgg cgggaaccaa gaacgtcggc actcgcacct 240

<210> 2

<211> 585

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

tgtggcccat gcgtccaggg aagttgcggt tggtggtgga cacgcattga aacggttcgt 60

tcatgcgtgc gtacgtatcg gccggccctc caaggcacgc agcgcacgac ggagatgcag 120

gttctaagca gccagcctcg cgaaaaattg aagccagcgt gcgcccttcg atctggcccg 180

tgttaaaaga tcaagggggc gtcttaagta tgggtgacta tcccctcgct gccgaacgaa 240

ccgccgggtg tattttacta agaatagcgt taccccacgt acatgttgca aacgttgatt 300

tgggtggacg aaacaacgtg tttcattgtt ttcgagcgat ccttgtcctc tatcaaacaa 360

acacgaattt ctcggcggag gctgcttgca gtgcatagcc gcacaataac atgaaacaca 420

aaatgcgtgc agttggacag caacatcacg tccaaggtga tgttgccaac cttttccatg 480

tgacagcact ttccatcaag tatggaacca ctagtacctt caaggtctgg atgtcgttgt 540

aaaccttttg ggtggcggga accaagaacg tcggcactcg cacct 585

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

cggagatgca ggttctaagc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

cgccacccaa aaggtttac 19