检测尿液病原菌的试剂盒及应用的制作方法

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及检测尿液病原菌的试剂盒及应用。

背景技术：

据世界组织统计，感染性疾病仍是发病率最高，引起人类死亡的主要原因。近30年来，由于大量广谱抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关微生物(包括细菌、病毒和某些寄生虫)的耐药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。对于临床微生物感染，尤其是较为常见的病原菌感染来说，快速准确地判断有无病原菌感染，一方面有利于临床及时展开进一步检测与治疗，另一方面减少了不必要的医疗资源浪费，最终有助于合理使用抗菌药物，避免抗生素的滥用，延缓耐药的发生。

三磷酸腺苷(ATP)普遍存在于细菌等微生物细胞内，是微生物新陈代谢的能量物质。对于一定生理时期内的活体微生物，均有较恒定水平的三磷酸腺苷(ATP)持有量，使得三磷酸腺苷(ATP)浓度与活体微生物含量之间有较好的线性关系。当微生物死亡后，其体内的ATP很快被胞内酶所降解，不会对活体微生物的测定产生影响。因此，可以运用三磷酸腺苷(ATP)生物发光法来衡量尿液病原菌含量。

三磷酸腺苷(ATP)生物发光法是基于荧光发光原理，通过检测三磷酸腺苷(ATP)与荧光素-荧光素酶反应的荧光光子量强度来实现ATP的检测，其原理是在荧光素酶E(luciferase)和Mg²⁺的作用下，荧光素LH₂(luciferin)与ATP发生腺苷酰化被活化，活化后的荧光素与荧光素酶相结合，形成了荧光素-AMP复合体，并放出焦磷酸(PPi)。该复合体被分子氧氧化，形成激发态复合物P*-E·AMP，放出CO₂，当该复合物从激发态回到基态时发射光，并最终形成氧化虫荧光素P和AMP。

反应过程如下：

E+LH₂+ATP→E·LH₂-AMP+PPi (1)

E·LH₂-AMP+O₂→[P*-E-AMP]+CO₂(2)

[P*-E-AMP]→E-P+AMP+hv (3)

在适当低的三磷酸腺苷(ATP)浓度范围内，其反应的速度与三磷酸腺苷(ATP)浓度成一级反应的关系，即检测的荧光值强度与ATP浓度成一定比例关系。正是由于被测样本所含细菌等微生物的数量与所含的ATP值、以及ATP值与发光值之间存在一定的函数关系，因此通过检测发光值即能得到被测标本所含细菌等微生物含量。ATP生物发光法的技术在临床尿液病原菌检测中没有相关试剂盒。

尿液病原菌检查是对尿路感染的检查，尿路感染是由病原菌(极少数可由真菌、原虫、病毒)直接侵袭所引起，因此尿液病原菌学检查对尿路感染的诊断与治疗有决定意义。目前临床上尿液病原菌的检测方法主要有细菌定量培养、显微镜检查、亚硝酸盐定性检测、全自动尿分析仪定量计数、DNA芯片技术等，细菌定量培养被认为是尿路感染的金标准，但是细菌培养技术要求高，多需2-4天才能获得结果，且培养阴性率高达70％-80％，检测费用也较高；显微镜检查可以缩短诊疗时间，但是人为分辨主观因素较大；亚硝酸盐定性检测可以初步判定是否存在菌尿，但是易受药物、食物的影响；全自动尿分析仪定量计数可对疑似尿路感染患者的尿液快速、无痛性筛查。但是该仪器价格偏高，基层医院难以接受,且无论活体菌还是已死亡菌都会统计在内；DNA芯片技术可以对尿液中的病原菌进行鉴定，鉴定结果可以直接用于做下一步的药敏，准确率高。但其成本比较高，技术要求高，通量检测程度低,基层医院一般难以接受。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种检测尿液病原菌的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题时提供上述检测尿液病原菌的试剂盒在检测尿液中病原菌含量的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

检测尿液病原菌的试剂盒，包括尿液前处理试剂、病原菌ATP裂解液、中和液、ATP检测试剂；

所述的尿液前处理试剂包括：体细胞消化液和ATP酶，所述的体细胞消化液包括体积分数为0.3～0.7％Triton和质量分数为0.03～0.07％TCA，所述的ATP酶为95～105U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶；

所述病原菌ATP裂解液包括：质量分数为2～5％TCA；

所述中和液包括：100～123.4mmol/L Tris-base、2～2.34mmol/L醋酸镁，pH为8.2；

所述的ATP检测试剂包括：12～20μg/mL荧光素酶、16～24μg/mL荧光素、18～22mmol/L Tris-base、1.5～2.5mmol/L醋酸镁，pH调至7.2～7.8。

作为优选，所述的体细胞消化液包括体积分数0.5％Triton和质量分数为0.05％TCA，所述的ATP酶为100U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶。

作为优选，所述病原菌ATP裂解液包括：质量分数为4％TCA。

作为优选，所述中和液包括：123.4mmol/L Tris-base、2.34mmol/L醋酸镁，pH为8.2。

作为优选，所述的ATP检测试剂包括：16μg/mL荧光素酶、20μg/mL荧光素、20mmol/L Tris-base、2mmol/L醋酸镁，pH调至7.6。

作为优选，所述尿液的包括血尿、乳糜尿、蛋白尿、一般尿液。

检测尿液中病原菌的方法，包括如下步骤：

(1)取尿液900μL，加入100μL体细胞消化液和5μL的三磷酸腺苷双磷酸酶，混匀后放入30度水浴锅中消化10min，然后2000g离心1min，弃沉淀后备用；

(2)取步骤(1)得到的上清液500μL进行过柱，过柱所用滤膜为0.45μm孔径的滤膜，小柱置于2mL套管上，然后6000g离心1min，弃滤液，加入生理盐水500μL清洗1次，再6000g离心1min，弃滤液，最后12000g甩30s，将小柱换入一个新的套管中，备用；

(3)在小柱中加入100μL病原菌ATP裂解液，常温下裂解5min，释放出病原菌中的ATP，后加入400μL中和液，离心，收集滤液；

(4)取出步骤(3)中滤液50μL于96孔微孔板中并放入orinII微孔板式发光检测仪中，把ATP检测试剂注入该仪器的进样器2中，通过进样器加入100μL荧光素酶反应液，加完后测量其发光值，检测时间为5s，记录其信号值。

上述检测尿液病原菌的试剂盒在检测尿液病原菌中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

本发明具有如下有益效果：

1、无需培养过程，相比于传统的病原菌培养方法，大大缩短了检测时间短。

2、避免主观因素，通过仪器检测，根据ATP信号值的高低来判断尿液中是否有病原菌干扰，可以避免人为的因素导致结果误判。

3、检测灵敏度高，与传统病原菌培养法比较，相关性高达90％以上。

4、通过对尿液的前处理，可以避免尿液中血细胞、蛋白、支原体、衣原体等物质的干扰。

5、试剂成本低廉，仪器占地面积小，适用于各中小医院开展实验。

本发明采用三磷酸腺苷(ATP)生物发光法建立一种快速检测尿液病原菌的技术体系，操作简便，检测快速、准确、灵敏，为临床尿路感染诊断提供一种可靠的方法，能降低临床无效用药，提高用药准确率，有助于减少抗生素滥用，最终减少患者痛苦和经济负担。

附图说明

图1常见病原菌的标准曲线。

图2ROC曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例中的试剂均为普通市购商品。

实施例1：尿液标本病原菌的标准曲线。

试验菌株：如下(表1)，购自广东省微生物菌种保藏中心。

表1标准菌株

尿液来源：采集多名健康志愿者中段尿液混合后使用。

尿液病原菌ATP检测试剂盒包括尿液前处理试剂、病原菌ATP裂解液、中和液、ATP检测试剂。尿液前处理试剂由体细胞消化液与ATP酶组成，体细胞消化液组成成分为0.3～0.7％Triton和0.03～0.07％TCA，ATP酶为95～105U/mL的APYrase；病原菌ATP裂解液为2～5％TCA；中和液由100～123.4mmol/LTris-base，2～2.34mmol/L醋酸镁组成，PH调至8.2；ATP检测试剂组成成分为荧光素酶、荧光素以及缓冲液，其中荧光素酶的浓度为12～20μg/mL，荧光素的浓度为16～24μg/mL，缓冲液由18～22mmol/L Tris-base与1.5～2.5mmol/L醋酸镁组成,PH调至7.2～7.8。

仪器:Orin II微孔板式发光检测仪；德国Berthold。

体外模拟尿液病原菌的检测过程如下：

取37度培养18-24h的大肠埃希菌，挑取2-3个纯菌平板单克隆菌落，制成菌悬液，用M-H肉汤培养基将菌液稀释成5*10⁷、5*10⁶、5*10⁵、5*10⁴、5*10³cfu/mL五种浓度；12000g离心收集沉淀，去上清，加入无菌尿1mL，振荡混匀，每个浓度重复3次。

取尿液900μL于2mL离心管中，分别加入尿液前处理试剂中的100μL体细胞消化液和5μL的ATP酶，混匀后放入30度水浴锅中消化10min，然后2000g离心1min，弃沉淀后备用；

取上清500μL菌悬液进行过柱，过柱所用滤膜为0.45μm孔径大小的滤膜，小柱置于2mL套管上，然后6000g离心1min，弃滤液，加入生理盐水500μL清洗1次，再6000g离心1min，弃滤液，最后12000g甩30s，将小柱换入一个新的套管中，备用；

在小柱中加入100μL 4％TCA裂解液，常温下裂解5min，得到ATP，后加入400μL中和液稀释，12000g离心30s，滤液备用进行ATP检测。

取滤液50μL于96孔微孔板中并放入Orin II微孔板式发光检测仪中，把ATP检测试剂注入该仪器的进样器中，通过进样器向检测穴中加入100μL荧光素酶反应液，加完一孔后立刻检测发光值，检测时间为5s；记录其信号值。

根据病原菌的ATP信号值以及相对应的浓度，取其对数值对标准菌株作出标准曲线，如图1

从检测统计结果分析，尿液中病原菌含量与ATP检测信号呈正相关性。从图中可以看出，采用生物荧光法对不同浓度病原菌分别进行检测，结果显示细菌在10⁴-10⁸cfu/mL，真菌在10,³-10⁷cfu/mL范围内，与ATP发光值的对数值之间呈线性关系，说明可以通过测定ATP含量值大致能区分出不同浓度的菌，ATP发光值越大，菌悬液含菌量越高。

生物荧光法测定的全过程仅需要几分钟，而病原菌计数法则需要1-2天以上，具有明显的优势。

实施例2：尿液标本病原菌ATP的检测临界值的确定。

尿液标本收集：224例尿标本来自本院微生物科室。

尿液病原菌ATP检测试剂盒包括尿液前处理试剂、病原菌ATP裂解液、中和液、ATP检测试剂。尿液前处理试剂由体细胞消化液与ATP酶组成，体细胞消化液组成成分为体积分数为0.5％Triton和质量分数为0.05％TCA，ATP酶为100U/mL的APYrase；病原菌ATP裂解液为质量分数为4％TCA；中和液由123.4mmol/L Tris-base,2.34mmol/L醋酸镁组成,PH调至8.2；ATP检测试剂组成成分为荧光素酶、荧光素以及缓冲液，其中荧光素酶的浓度为16μg/mL，荧光素的浓度为20μg/mL，缓冲液由20mmol/L Tris-base与2mmol/L醋酸镁组成,PH调至7.6。

仪器Orin II微孔板式发光检测仪：德国Berthold。

将上述尿液一分为二，一部分直接涂血平板，一部分经处理后进行ATP检测。

尿液ATP检测步骤如下：

取尿液900μL于2mL离心管中，分别加入尿液前处理试剂中的100μL体细胞消化液和5μL的ATP酶，混匀后放入30度水浴锅中消化10min，然后2000g离心1min，弃沉淀后备用；

取上清500μL菌悬液进行过柱，过柱所用滤膜为0.45μm孔径大小的滤膜，小柱置于2mL套管上，然后6000g离心1min，弃滤液，加入生理盐水500μL清洗1次，再6000g离心1min，弃滤液，最后12000g甩30s，将小柱换入一个新的套管中，备用；

在小柱中加入100μL4％TCA裂解液，常温下裂解5min，得到ATP，后加入400μL中和液稀释，12000g离心30s，滤液备用进行ATP检测。

取滤液50μL于96孔微孔板中并放入Orin II微孔板式发光检测仪中，把ATP检测试剂注入该仪器的进样器中，通过进样器首先向检测穴中加入100μL荧光素酶反应液，加完一孔立刻测量发光值，检测时间为5s；记录其信号值。

将224例尿液标本病原菌ATP信号值进行统计，使用非参数方法构建ROC曲线，并以Youden指数最大切点为临界点。目前，血平板涂布计数认为临床尿路感染诊断的金标准，以涂板计数≥10⁴为阳性1，<10⁴为阴性0，作为动态数据，ATP检测尿液样本RLU作为检验变量。运用spass 19.0进行ROC曲线分析得得到的灵敏度和特异度，并以灵敏度为纵坐标轴，(1-特异度)为横坐标轴绘制的ROC曲线(图2)。

通过ROC曲线分析得到的224例测试样本中生成的连续阈值和对应的敏感度以及1-特异性，并计算出相应的Youden指数范围(0-0.89)。并结合临床标本实际情况，最终确定ATP信号值≥260为ROC最佳临界点，即若样本ATP检测信号≥260RLU，则样本检测结果为阳性，有病原菌感染；若样本ATP检测信号<260RLU，则样本检测结果为阴性，无病原菌感染。

尿液标本的细菌学检查不仅有助于泌尿道感染的诊断，并可作为选择有效抗菌药物进行治疗，判断疗效的指标。正常人膀胱中的尿液是无菌的，一般认为尿液细菌计数不应超过10⁴-10⁵cfu/mL，若每毫升尿液细菌10⁵CFU/mL以上时，应考虑为尿路感染。若每毫升尿液细菌数小于10⁴cfu/mL，考虑污染。但是中段尿在10⁵CFU/mL以下时，不能完全排除尿路感染的可能。目前认为由革兰阴性杆菌引起的菌尿，细菌数均可达到10⁵CFU/mL以上，而革兰阳性球菌引起的菌尿，细菌数达到10⁴CFU/mL即可诊断为尿路感染。因此基于临床尿路感染诊断标准要求，确定一个260RLU为临界值，可尽可能地检测出10⁴CFU/mL细菌及10³CFU/mL真菌以上的含菌尿液。

实施例3：临床尿标本病原菌ATP的检测。

尿液标本收集：1055例尿标本来自三家三甲医院。

尿液病原菌ATP检测试剂盒包括尿液前处理试剂、病原菌ATP裂解液、中和液、ATP检测试剂。尿液前处理试剂由体细胞消化液与ATP酶组成，体细胞消化液组成成分为体积分数为0.5％Triton和质量分数为0.05％TCA，ATP酶为100U/mL的APYrase；病原菌ATP裂解液为4％TCA；中和液由123.4mmol/L Tris-base,2.34mmol/L醋酸镁组成,PH调至8.2；ATP检测试剂组成成分为荧光素酶、荧光素以及缓冲液，其中荧光素酶的浓度为16μg/mL，荧光素的浓度为20μg/mL，缓冲液由20mmol/L Tris-base与2mmol/L醋酸镁组成,PH调至7.6。

仪器Orin II微孔板式发光检测仪：德国Berthold。

将上述尿液一分为二，一部分直接涂血平板，一部分经处理后进行ATP检测。

尿液ATP检测步骤如下：

取尿液900μL于2mL离心管中，分别加入尿液前处理试剂中的100μL体细胞消化液和5μL的ATP酶，混匀后放入30度水浴锅中消化10min，然后2000g离心1min，弃沉淀后备用；

取上清500μL菌悬液进行过柱，过柱所用滤膜为0.45μm孔径大小的滤膜，小柱置于2mL套管上，然后6000g离心1min，弃滤液，加入生理盐水500μL清洗1次，再6000g离心1min，弃滤液，最后12000g甩30s，将小柱换入一个新的套管中，备用；

在小柱中加入100μL裂解液，常温下裂解5min，得到ATP，后加入400μL中和液稀释，12000g离心30s，滤液备用进行ATP检测。

取滤液50μL于96孔微孔板中并放入Orin II微孔板式发光检测仪中，把ATP检测试剂注入该仪器的进样器中，通过进样器首先向检测穴中加入100μL荧光素酶反应液，加完一孔立刻测量发光值，检测时间为5s；记录其信号值。

以血平板涂布计数作为金标准，即血平板计数≥1*10⁴CFU/mL的菌落为阳性，<1*10⁴CFU/mL的菌落为阴性。尿液病原菌ATP检测试剂盒的判断标准是：样本ATP检测信号≥260RLU，则样本检测结果为阳性，有病原菌感染；若样本ATP检测信号<260RLU，则样本检测结果为阴性，无病原菌感染。根据判断标准将1055例尿液标本病原菌的结果统计如下(表2)

表2考核试剂与参比方法为“金标准”的汇总结果

通过1055例临床试验验证，血平板涂布计数作为临床尿路感染的判断金标准，尿液病原菌ATP检测试剂盒的临床灵敏度为94.92％(95％CI 92.66％,96.15％)，特异性为91.34％(95％CI 88.68％,93.43％)，总符合率为93.08％(95％CI 91.39％,94.46％)，阳性预测值为91.18％(95％CI 88.47％,93.30％)，阴性预测值为95.02％(95％CI 92.80％,96.58％)，阳性似然比为10.97(95％CI 10.52,11.44)，阴性似然比为0.06(95％CI 0.05,0.06)，Kappa系数为0.862(95％CI 0.831,0.892)，综合以上结果表明尿液病原菌ATP检测试剂盒与血平板涂布计数具有临床等效性，可以用来协助临床微生物检测，且该方法快速简便，有利于临床进行下一步的检查。

综上所述，以上实验说明本发明使用ATP生物发光法检测尿液病原菌含量，无需培养过程，操作简单，而且灵敏度高，可在较短时间内得到测定结果，相比于其他的微生物检测方法具有明显的优势。其使用试剂成本低，易于配置，且检测结果避免人的主观判断。说明ATP生物发光法测定尿液病原菌定量的方法是可行的，可以作为临床上一种快速有效的微生物检测办法，从而为临床治疗提供有效的依据。