一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒的制作方法

本发明属于医学真菌学的领域，具体涉及用于隐球菌特定靶基因检测的引物和探针及试剂盒。

背景技术：

目前隐球菌属的种类较多，在自然界分布广泛，与人类感染最密切的主要有新生隐球菌和格特隐球菌，他们均可导致人类肺部或中枢神经系统隐球菌病，也可致全身播散性感染。格特隐球菌曾引起加拿大温哥华地区及美国西北部地区爆发流行，近年来欧洲和我国也有感染病例报告，在我国，格特隐球菌主要分布在上海、江苏、福建、浙江、广东、海南、河北等省份，新生隐球菌各地均有散发病例。新生隐球菌主要感染免疫缺陷患者，格特隐球菌则主要引起免疫正常人群患病。一般认为，格特隐球菌致病性和耐药性均高于新生隐球菌。

由于隐球菌感染后的临床表现不典型，容易误诊为细菌性感染，病原学检测成为诊断和治疗的依据。尽管脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但敏感性低；隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但不能区分两种主要的致病性隐球菌；隐球菌培养鉴定不仅需时较长，而且多数自动化鉴定仪难以鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，导致实验室只能报告隐球菌，或有可能错误地将格特隐球菌报告为新生隐球菌。正确检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌有赖于新的技术和方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于隐球菌特异性检测的靶基因，能够作为检测靶标准确检测并鉴别出两种重要的致病性隐球菌而不会被误诊为细菌。

本发明的另一个目的是基于该特异性靶基因位置而设计的检测引物和探针，准确鉴别出新生隐球菌与格特隐球菌两种不同的致病性隐球菌类型。

本发明的又一目的是提供一种快速检测试剂盒，能够方便快捷地检测并鉴定新生隐球菌与格特隐球菌。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

本发明提供一种检测隐球菌的特定靶基因，靶基因序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示，其中SEQ ID No.1对应于新生隐球菌，SEQ ID No.2对应于格特隐球菌，特定靶基因序列应用于制备隐球菌检测试剂。

用于检测新生隐球菌的引物和探针，以SEQ ID No.1所示核苷酸序列为模板设计，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列为引物，以SEQ ID No.5所示核苷酸序列为探针，具体序列如下：

上游引物CN2F(5’-cttactcggcacaactccac-3’)：SEQ ID No.3；

下游引物CN2R(5’cggtgaatcaaatgacgtacctc-3’)：SEQ ID No.4；

探针CN2P(HEX-ccaccgatcacacatccacgtgctc-BHQ1)：SEQ ID No.5；

其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

用于检测新生隐球菌的试剂盒，包括用于检测新生隐球菌的引物CN2F、CN2R和探针CN2P，还包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq DNA聚合酶等。

用于检测格特隐球菌的引物和探针，以SEQ ID No.2所示核苷酸序列为模板设计，以SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示核苷酸序列为引物，以SEQ ID No.8所示核苷酸序列为探针，具体序列如下：

上游引物CG3F(5’-atcaccttcacccaggagaa-3’)：SEQ ID No.6；

下游引物CG3R(5’-ggaaatcaaacgacttacg-3’)：SEQ ID No.7；

探针CG2P(FAM-aggagaaggagggtgctcccgttac-BHQ1)：SEQ ID No.8；

其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

用于检测格特隐球菌的试剂盒，包括用于检测格特隐球菌的引物CG3F、CG3R和探针CG2P，还包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq DNA聚合酶等。

用于检测隐球菌的试剂盒，能够同时检测新生隐球菌和格特隐球菌，包括用于检测新生隐球菌的引物CN2F、CN2R和探针CN2P，还包括用于检测格特隐球菌的引物CG3F、CG3R和探针CG2P，还包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs、Taq DNA聚合酶等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明关键在于特异性靶基因位置的选择及引物和探针的设计。实验证实，使用所设计的引物和探针检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的特异性和敏感性均较好。本发明通过比对新生隐球菌和格特隐球菌不同基因型之间及其与其他真菌基因的序列差异，选择铜锌超氧化物歧化酶部位的序列片段作为靶基因，设计出引物和探针，使对新生隐球菌和格特隐球菌进行检测和鉴定过程中的敏感性高、特异性强。检测时间短，本发明将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可分别检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，亦可同时检测，明确病原菌种类，使对新生隐球菌和格特隐球菌进行检测和鉴定的时间大大缩短，帮助临床诊断，赢得治疗时间。

附图说明

图1示所述新生隐球菌在不同浓度DNA(500ng，50ng，5ng，0.5ng)的扩增曲线；

图2示所述格特隐球菌在不同浓度DNA(500ng，50ng，5ng，0.5ng)的扩增曲线；

图3示所述新生隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，B族链球菌，流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌及光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，结果均为阴性(基线下方的曲线)；

图4示所述格特隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，B族链球菌，流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌及光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，结果均为阴性(基线下方的曲线)；

图5示所述新生隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图6示所述格特隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图7示所述退火温度60℃时，新生隐球菌的扩增曲线(Ct:25.32)；

图8示所述退火温度60℃时，格特隐球菌的扩增曲线(Ct:24.51)；

图9示所述退火温度62℃时，新生隐球菌的扩增曲线(Ct:24.63)；

图10示所述退火温度62℃时，格特隐球菌的扩增曲线(Ct:24.56)；

图11示所述退火温度58℃时，新生隐球菌的扩增曲线(Ct:25)；

图12示所述退火温度58℃时，格特隐球菌的扩增曲线(Ct:23.83)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面通过具体实施方式对本发明提供的新生隐球菌和格特隐球菌快速检测的引物、探针和方法做进一步说明。

实施例1：新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的靶基因、引物、探针及其试剂盒

步骤1：靶基因位置的选择

本发明的发明人通过比对新生隐球菌和格特隐球菌不同基因型之间及其与其他真菌基因的序列差异，选择铜锌超氧化物歧化酶部位的序列片段作为靶基因位置，该基因片段为隐球菌所特有，并在新生隐球菌和格特隐球菌间存在差异。得到的一种检测新生隐球菌和格特隐球菌靶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示，其中SEQ ID No.1对应于新生隐球菌，SEQ ID No.2对应于格特隐球菌。

步骤2：引物和探针的设计

针对选择的靶基因位置，采用primer设计软件，进行引物设计。通过反复对比分析及前期的预实验。最终获得以下两对引物和两条探针。

用于检测新生隐球菌的引物和探针，具体序列如下：

上游引物CN2F：SEQ ID No.3；

下游引物CN2R：SEQ ID No.4；

探针CN2P：SEQ ID No.5；

其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

用于检测格特隐球菌的引物和探针，具体序列如下：

上游引物CG3F：SEQ ID No.6；

下游引物CG3R：SEQ ID No.7；

探针CG2P：SEQ ID No.8；

其中探针序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。

步骤3：荧光定量PCR检测

A.实验材料

a.实验菌株

实验菌株采用经过基因序列分析确认的新生隐球菌和格特隐球菌临床菌株及经常规鉴定的其他细菌(包括大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，B族链球菌，流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌)和真菌(包括光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌)。

b.试剂与仪器

DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒，用BioTek公司的EPOCH microplate reader检测其OD260吸光度值，并得到其浓度和纯度；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶和dNTPs购自Takara公司荧光定量PCR仪采用Roche公司的Light cycler 480。

B.实验方法

a.DNA提取和浓度测定：按照天根公司酵母基因提取试剂盒说明书提取DNA，用BioTek公司的EPOCH microplate reader检测其OD260吸光度值，并得到其浓度和纯度。

b.引物配制：将新合成的所有引物和探针溶解后配制成50μM的保存液，再将CN2F、CN2R、CN2P、CG3F、CG3R、CG2P分别配制为8μM的使用液。CN2P和CG2P要避光保存。

c.反应体系：反应体系总计25μL。包括：10×缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂3.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，8μM的引物(CN2F、CN2R、CG3F、CG3R)各2μL，8μM的探针(CN2P、CG2P)各1.25μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶(5u/μL)0.25μL，用水补足至25μL。荧光定量PCR扩增反应体系中各引物(CN2F、CN2R、CG3F、CG3R)的浓度为0.64μM，探针(CN2P、CG2P)的浓度为0.4μM。

d.反应条件：95℃，10min后进入45个循环(包括95℃10s，60℃60s)。反应结束后回到室温。

步骤4：结果的判定

结合明确的扩增曲线形态(具有基线期，指数期、线性期和平台期)及达到荧光阈值所需的循环数(CT值)≤26判读为阳性。

步骤5：敏感度和重复性检测

A.敏感性高：将提取的新生隐球菌和格特隐球菌的模板DNA稀释成以下浓度：500ng，50ng，5ng，0.5ng，经荧光定量PCR方法检测得到新生隐球菌和格特隐球菌的最低可检测浓度均为5ng，如图1和图2所示。

B.特异性强：所设计的引物分别对新生隐球菌和格特隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能进一步鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。对从临床分离出来的菌株采用所设计的引物、探针和方法进行检测，得到的格特隐球菌和新生隐球菌鉴定结果经基因测序分析获得确认。平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，B族链球菌，流感嗜血杆菌，结核分枝杆菌及光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，结果均为阴性，没有非特异性扩增曲线，如图3和图4。

C.重复性好：将新生隐球菌(100ng)和格特隐球菌(90ng)分别重复试验，各自三个反应的结果一致，如图5和图6。

D.检测时间短：扩增反应中退火及延伸温度设置为相同温度，退火时间分别设置为60℃、62℃和58℃，经过对比优化，确定60℃为最佳退火及延伸温度，如图7、图8、图9、图10、图11和图12所示。由于反应中的循环温度较一般扩增反应减少了一个，缩短了扩增反应所需的时间。

步骤6：制备新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的试剂盒，试剂盒中包括：10×缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 3.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，8μM的引物(CN2F、CN2R、CG3F、CG3R)各2μL，8μM的探针(CN2P、CG2P)各1.25μL，DNA模板2μL，Taq DNA聚合酶(5u/μL)0.25μL，用水补足至25μL。

实施例2：新生隐球菌基因检测与鉴定的引物、探针及试剂盒

将实施例1中步骤3的检测新生隐球菌与格特隐球菌的引物(CN2F、CN2R、CG3F、CG3R)改为检测新生隐球菌的引物CN2F和CN2R，检测新生隐球菌与格特隐球菌的探针(CN2P、CG2P)改为检测新生隐球菌的探针CN2P，并完成实验剩余步骤，所设计的引物对新生隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能进一步鉴定新生隐球菌。

实施例3：格特隐球菌基因检测与鉴定的引物、探针及试剂盒

将实施例1中步骤3的检测新生隐球菌与格特隐球菌的引物(CN2F、CN2R、CG3F、CG3R)改为检测格特隐球菌的引物CG3F和CG3R，检测新生隐球菌与格特隐球菌的探针(CN2P、CG2P)改为检测格特隐球菌的探针CG2P，并完成实验剩余步骤，所设计的引物对格特隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能进一步鉴定格特隐球菌。

使用本发明的引物和探针对临床感染患者进行病原菌检测，临床病例验证为下表：

新生隐球菌与格特隐球菌感染患者相关临床资料与菌株鉴定结果

以上对本发明所提供的检测隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军总医院

<120> 一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒

<130> P20170026

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ggtccccttc cttcctctgt ctctcccacc tctcgggtct ccgcgctctc ccgcccatcc 120

tcctccccta tcttattgcg caatcatgaa accacgccgg tcttcttact cggcacaact 180

ccaccgatca cacatccacg tgctcgcctc atcgccccta cgatgtttca tccaaacaat 240

gcgaaataac cattataggc tgttgttgtc ctcaagggtg aatcctacgt ccacggcact 300

gtatgcttca cccaggagtc ggaaaatgct cccgtttgca tcactggtga ggtacgtcat 360

tggattcatc gtggagtaac atccggtcgc tgacatgata atcactgatc agattaagga 420

catggacgct gacgccaagc gaggcatgca cgtccacgag tttggagaca acaccaacgg 480

ctgtacctct gctggccccc attacaaccc ctttaaaaag caccacggtg ctcccaccga 540

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acccaggaga aggagggtgc tcccgttacc gtttccggtg acgtaagtcg tttgatttcc 180

aatagggtaa ccatttgctg acttggtaat cactgattag atcaagaacc tcgacgccaa 240

cgccgagcga ggcttccacg tccacgagtt tggagacaac accaacggct gtacctctgc 300

cggtccccac ttcaaccccc acggcaagaa ccacggtgct ccctctgact ctgagaggca 360

cgttggtgac ctcggtatgt gccccttgcc tcatggcgtt gcttttgctg actgtatata 420

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