体液悬浮细胞DNA提取试剂盒及提取方法与流程

本发明属于生物学领域，本发明涉及一种提取体液(如羊水、血液、唾液、尿液)的悬浮细胞DNA提取试剂盒及提取方法。
背景技术：
：机体中所含有水和分散在水里的各种物质总称为体液，体液可分为两大部分：细胞内液和细胞外液。本发明所述的体液指的为细胞外液；可分为血液、组织间隙液、淋巴液、脑脊液、尿液、唾液、精液等，另还有一些特殊的体液例如羊水。体液悬浮细胞指的是在体液中游离的细胞，例如羊水中游离的胎盘细胞，尿液中游离的上皮细胞，血液中游离的白细胞等等；这些细胞都反映着机体健康状态，因此可以通过检测体液悬浮细胞对疾病进行早期预警或预后判断。例如，可以通过检测羊水中游离的胎盘细胞DNA对胎儿是否患有唐氏综合症或其他遗传病疾病进行确认，通过检测尿液中的游离细胞DNA可以达到对膀胱癌早期筛查的作用。对体液悬浮细胞检测最常见方法就是对细胞提取DNA后进行检测，DNA一级结构的完整性，DNA的产量和DNA的纯度是DNA提取过程中的重要指标。然而，体液成分组成复杂，且部分体液中悬浮细胞量很少(例如羊水)，部分体液中成分复杂，因此在提取过程中纯度、产量和完整性三个指标难以同时满足。且体液悬浮细胞DNA提取试剂盒主要用于临床样本的提取，因此，如何有效的控制提取试剂盒的成本，也是体液悬浮细胞DNA在应用时需要考虑的重要因素。目前常见的DNA提取方法主要有三种：柱离心法、酚氯仿抽提法和磁珠法。柱离心法的原理是特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA(在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA)；然而柱离心法的DNA产量与最后洗脱步骤的洗脱效率有一定关系，而且在DNA洗涤过程中也会造成一定量的DNA损失，高速离心的情况下还会影响提取DNA的完整性，因此不适合细胞量少且对DNA完整性有一定需求的体液悬浮细胞DNA提取。酚氯仿抽提法是利用苯酚反复抽提，使蛋白质变性，同时DNA易溶于水而不溶于有机溶剂的原理来提取DNA，但是苯酚和氯仿都是有毒的有机溶液，对人体伤害较大，在应用上存在一定的局限性。磁珠法是采用了微纳米级磁性微珠，这种磁珠微珠的表面包裹一层硅材料来吸附核酸，进而通过磁铁吸附从而达到分离核酸的目的。但是由于该方法对磁珠性能要求较高，提取DNA的效率与磁珠的性能有密切关联，但目前市售磁珠的性能参差不齐，而高端的磁珠价格昂贵，限制了该方法的应用。中国发明专利CN104560959A提供了一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒和方法。该试剂盒包括红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；其中，所述红细胞裂解液包含8.29g/L的NH4Cl，31g/L的KHCO3和0.37g/L的Na2EDTA，pH7.2-7.4；所述去蛋白液为10％SDS，所述去蛋白沉淀液为饱和氯化钠溶液，所述调节结合液为异丙醇，所述洗脱液为70％乙醇，所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml，是本申请的最接近现有技术，该方法可以实现对血液中的DNA进行提取并且进行PCR扩增，但较血液而言，部分体液成分组成复杂(如唾液)；部分体液中悬浮细胞量很少(例如羊水)，因此在提取过程中纯度、产量和完整性三个指标更难以同时满足，同时该发明中去蛋白液浓度高，采用10％的SDS在低温下(10℃)容易产生沉淀，需要加热溶解，使用不方便、经济成本高，最重要一点，该方法不能完成对其他体液悬浮细胞DNA提取的目的，实用性受到限制。因此开发一种成本低、无有毒有机溶液、提取DNA浓度较高、完整性好且适用于多种体液悬浮细胞DNA提取的方法及试剂盒可很好的改善当前体液悬浮细胞DNA的临床检测准确性并降低检测成本，具有重要的理论意义及实践意义。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。为了实现根据本发明的上述目的和其他优点，本发明提供一种体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，包括：重悬液、蛋白酶K溶液、RNA酶A溶液、裂解液、沉淀剂、洗涤液A、洗涤液B和DNA溶解液；所述重悬液选自磷酸盐缓冲液、生理盐水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述裂解液包括主裂解剂与辅助裂解剂；所述主裂解剂选自2-8mol/L盐酸胍、2-8mol/L硫氰酸胍、0.1-9.9％SDS或其组合；所述辅助裂解剂为Triton-100和/或吐温；所述的蛋白酶K溶液的浓度为10-19mg/mL；所述沉淀剂选自3-5mol/L的氯化钾溶液和或3-6mol/L的硫酸铵溶液；所述洗涤液A为无水乙醇或95v/v％乙醇溶液；所述洗涤液B为71-80v/v％乙醇溶液；所述的DNA溶解液选自去离子水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述的RNA酶A溶液的浓度为10-30mg/mL。优选的，所述裂解液还包括：DNA酶活性抑制剂和/或粘液清除剂；所述DNA酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚溶液；所述粘液清除剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液。优选的，所述氟苯哌苯醚溶液的浓度为0.1-5mmol/L,该氟苯哌苯醚溶液中还含有0.1-0.4％的吐温帮助溶解，提高氟苯哌苯醚溶在水中的溶解性；所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液的浓度为1-10mmol/L。优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1-100mmol/L；所述添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液为1-100mmol/LTris-HCl溶液和1-10mmol/LEDTA溶液的混合液；所述Triton-100的浓度为2-8v/v％；所述吐温为吐温20或吐温60或吐温80。上述试剂盒提取体液悬浮细胞DNA的方法，也是本发明要求保护的的内容，包括以下操作步骤S1：取0.1-10mL体液，2000-13000rpm离心3-20分钟；S2：弃上清，加入1-5mL重悬液；将离心下来的沉淀重悬后2000-13000rpm离心3-20分钟，弃上清；S3：加入100-500μL裂解液、2-20μL蛋白酶K溶液、2-20μLRNA酶A溶液，室温裂解10-30分钟后-20℃静置2分钟；S4：加入10-200μL沉淀剂，8000-15000rpm离心1-10分钟；S5：将上清转移至新的离心管中，加入200-1000μL洗涤液A，在-20或-80℃温度下静置5-60分钟后8000-15000rpm离心1-10分钟；S6：弃上清，加入200-1000μL洗涤液B，8000-15000rpm离心1-10分钟；S7：弃上清，室温干燥1-10分钟；S8：加入20-100μLDNA溶解液即可。优选的，所述裂解液还包括：DNA酶活性抑制剂和/或粘液清除剂；所述DNA酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚溶液；所述粘液清除剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液。优选的，所述氟苯哌苯醚溶液的浓度为0.1-5mmol/L,该氟苯哌苯醚溶液中还含有0.1-0.4％的吐温；所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液的浓度为1-10mmol/L。优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1-100mmol/L；所述添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液为1-100mmol/LTris-HCl溶液和1-10mmol/LEDTA溶液的混合液；所述Triton-100的浓度为2-8v/v％；所述吐温为吐温20或吐温60或吐温80。优选的，所述洗涤液A和洗涤液B置于-20℃温度以下预冷处理30分钟后使用。氟苯哌苯醚是一种苯基呃啶衍生物，是SSRI,可选择性地抑制5-HT转运体，阻断突触前膜对5-HT的再摄取，延长和增加5-HT的作用，从而产生抗抑郁作用，现有技术被应用作为抗抑郁类药物，本发明添加氟苯哌苯醚能够抑制DNA酶活性，提高提取过程中DNA纯度及产量。N-乙酰基-L-半胱氨酸为白色结晶性粉末，有类似蒜的气味，味酸。有吸湿性，易溶于水或乙醇，不溶于乙醚、氯仿。在水溶液中呈酸性(10g/LH2O中pH2-2.75)，mp101-107℃，N-乙酰基-L-半胱氨酸为半胱氨酸的N-乙酰化衍生物，分子中含有巯基，能使黏蛋白肽键的二硫键(-S-S-)断裂，从而使黏蛋白链变成小分子肽链，降低粘蛋白的黏滞性，为黏痰、脓性痰、呼吸道黏液的溶解药，生化试剂，医药，该品用作祛痰药，称痰易净，易咳静。对粘稠的痰液有分解作用，其作用机理是该品分子结构中所含的巯基能使粘痰中粘蛋白多肽链中的二硫键断裂，使粘蛋白分解，降低了痰液的粘度，使之液化易于咳出，适用于急，慢性呼吸道疾病的痰液粘稠不易咳出者，以及大量粘痰阻塞而引起吸吸因难的危重症状。本发明将N-乙酰基-L-半胱氨酸应用作为粘液清除剂，在裂解过程中添加粘液清除剂，克服提取过程中由于存在粘液(例如唾液)而到导致的提取困难，提高提取过程中DNA纯度及产量。本发明与现有技术相比，其有益效果是：1.本发明试剂盒适用于稀有样本的DNA提取，例如羊水细胞，并且提取样本种类广阔，可以用于血液、唾液、羊水、尿液等含有悬浮细胞的可流动的体液，本发明提取的DNA可用于荧光定量PCR、高通量测序等分子生物学实验。2.本发明裂解液添加量低、裂解温度温和、成本低，能够有效的控制提取试剂盒的成本，同时在提取过程中DNA纯度、产量和完整性三个指标能够得以同时满足，提高应用效果，具有广阔的应用前景。3.本发明添加DNA酶活性抑制剂可以提高提取过程中DNA的完整性及产量，该酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚。4.本发明添加N-乙酰基-L-半胱氨酸作为粘液清除剂，可以清除唾液样本中痰液粘液，提高唾液DNA提取的产量和纯度。附图说明图1.本发明实施实例1试剂盒与凯杰DNeasyBlood&TissueKit同时提取羊水DNA琼脂糖凝胶电泳结果图2.本发明实施实例2试剂盒和实施实例3试剂盒分别提取3例血液DNA琼脂糖凝胶电泳结果图3.本发明实施实例4试剂盒与对比例3试剂盒同时提取2个唾液样本DNA琼脂糖凝胶电泳结果具体实施方式实施实例1提取对象：羊水其中重悬液为磷酸盐缓冲液；裂解液为2mol/L的硫氰酸胍、0.1％的SDS溶液、0.1％的吐温20及5mmol/L的氟苯哌苯醚，其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为10mg/mL；RNA酶A溶液浓度为10mg/mL；沉淀剂为5mol/L氯化钾溶液，洗涤液A为无水乙醇，洗涤液B为71％乙醇，DNA溶解液为去离子水，操作步骤为：S1:取3mL羊水2000rpm离心10分钟；S2:弃上清，加入2mL重悬液重悬后，2000rpm离心10分钟；S3:弃上清，加入400μL裂解液，10μL蛋白酶K溶液，10μLRNA酶A溶液，室温温裂解15分钟后-20℃静置2分钟；S4:加入100μL沉淀剂，10000rpm离心10分钟；S5:将上清转移至新的离心管中，加入500μL洗涤液A，在-20℃温度下静置20分钟后10000rpm离心10分钟；S6:弃上清，加入1000μL洗涤液B，10000rpm离心10分钟；S7:弃上清，室温干燥5分钟。S8:加入50μLDNA溶解液得到DNA溶液。本实施实例中所述洗涤液A和洗涤液B置于-20℃温度以下预冷处理30分钟后使用。为对比本发明试剂盒的效果，采用凯杰DNeasyBlood&TissueKit与本试剂盒提取同样来源的羊水细胞DNA，提取步骤参照凯杰DNeasyBlood&TissueKit。表1.实施实例1本发明试剂盒与凯杰DNeasyBlood&TissueKit同时提取羊水DNA浓度及A260/A280、A260/A230数据对比通过图1和表1数据可以看出本发明试剂盒相比较凯杰DNeasyBlood&TissueKit提取羊水DNA浓度更高，纯度更高，完整性更好，DNA片段长度超过20kb。实施实例2提取对象：血液其中重悬液为1mmol/LEDTA与10mmol/LTris-HCl的混合液；裂解液为8mol/L盐酸胍及8v/v％Triton-100，其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为19mg/mL；RNA酶A溶液浓度为10mg/mL；沉淀剂为3mol/L氯化钾与1mol/L的硫酸铵的混合溶液，洗涤液A为无水乙醇，洗涤液B为80％乙醇，DNA溶解液为1mmol/L的EDTA和100mmol/L的Tris-HCl的混合溶液；操作步骤为：S1:取100μL新鲜血液13000rpm离心1分钟；S2:弃上清，加入1mL重悬液重悬后，13000rpm离心1分钟；S3:弃上清，加入200μL裂解液，20μL蛋白酶K溶液，20μLRNA酶A溶液，室温裂解30分钟后-20℃静置2分钟；S4:加入50μL沉淀剂，13000rpm离心5分钟；S5:将上清转移至新的离心管中，加入400μL洗涤液A，在-80℃温度下静置20分钟后13000rpm离心10分钟；S6:弃上清，加入500μL洗涤液B，13000rpm离心5分钟；S7:弃上清，室温干燥5分钟。S8:加入50μLDNA溶解液得到DNA溶液。本实施实例中所述洗涤液A和洗涤液B置于-20℃温度以下预冷处理30分钟后使用。实施实例3提取对象：血液其中重悬液为生理盐水；裂解液为2mol/L的盐酸胍、2mol/L的硫氰酸胍、5％的Triton-100、0.1％的吐温80及1mmol/L氟苯哌苯醚溶液，其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为10mg/mL；RNA酶A溶液浓度为20mg/mL；沉淀剂为6mol/L硫酸铵溶液，洗涤液A为95％乙醇溶液，洗涤液B为75％乙醇，DNA溶解液为10mmol/L的Tris-HCl溶液，操作方法包括以下步骤：S1:取50μL新鲜血液13000rpm离心1分钟；S2:弃上清，加入1mL重悬液重悬后，13000rpm离心1分钟；S3:弃上清，加入250μL裂解液，10μL蛋白酶K溶液，10μLRNA酶A溶液，室温裂解30分钟后-20℃静置2分钟；S4:加入100μL沉淀剂，13000rpm离心5分钟；S5:将上清转移至新的离心管中，加入500μL洗涤液A，在-20℃温度下静置50分钟后13000rpm离心10分钟；S6:弃上清，加入500μL洗涤液B，13000rpm离心5分钟；S7:弃上清，室温干燥2分钟。S8:加入50μLDNA溶解液得到DNA溶液。本实施实例中所述洗涤液A和洗涤液B置于-20℃温度以下预冷处理30分钟后使用。表2.本发明实施实例2和实施实例3分别提取3例血液DNA浓度及A260/A280、A260/A230数据通过图2和表2可以看出本发明试剂盒提取血液DNA纯度好，完整性高，产量高,裂解液中添加氟苯哌苯醚溶液，能够提高DNA的纯度和产量。实施实例4提取对象：唾液其中重悬液为100mMTris-HCl；裂解液为2mol/L的盐酸胍、2mol/L的硫氰酸胍、5％的Triton-100、0.1％的吐温80及2mmol/L氟苯哌苯醚溶液、2mmol/L的N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液，其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为10mg/mL；RNA酶A溶液浓度为30mg/mL；沉淀剂为4mol/L硫酸铵溶液，洗涤液A为95％乙醇，洗涤液B为75％乙醇，DNA溶解液为100mmol/L的Tris-HCl溶液，操作方法包括以下步骤：S1:取100μL唾液13000rpm离心1分钟；S2:弃上清，加入1mL重悬液重悬后，13000rpm离心1分钟；S3:重复步骤2一次；S4:弃上清，加入500μL裂解液，10μL蛋白酶K溶液，10μLRNA酶A溶液，室温裂解10分钟后-20℃静置2分钟；S5:加入200μL沉淀剂，13000rpm离心5分钟；S6:将上清转移至新的离心管中，加入1000μL洗涤液A，在-80℃温度下静置5分钟后13000rpm离心10分钟；S7:弃上清，加入1000μL洗涤液B，13000rpm离心5分钟；S8:弃上清，室温干燥10分钟。S9:加入40μLDNA溶解液得到DNA溶液。本实施实例中所述洗涤液A和洗涤液B置于-20℃温度以下预冷处理30分钟后使用。对比例1提取对象：与实施实例1相同羊水样本其中重悬液为磷酸盐缓冲液；裂解液为10％的SDS溶液，其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为10mg/mL；RNA酶A溶液浓度为10mg/mL；沉淀剂为5mol/L氯化钾溶液，洗涤液A为无水乙醇，洗涤液B为71％乙醇，DNA溶解液为去离子水；其操作步骤与实施实例1相同。对比例2提取对象：与实施实例1同一羊水样本所述试剂盒组分与实施实例1相同，其操作步骤为：S1:取3mL羊水2000rpm离心10分钟；S2:弃上清，加入2mL重悬液重悬后，2000rpm离心10分钟；S3:弃上清，加入400μL裂解液，10μL蛋白酶K溶液，10μLRNA酶A溶液，室温裂解15分钟后-20℃静置2分钟；S4:加入100μL沉淀剂，10000rpm离心10分钟；S5:将上清转移至新的离心管中，加入500μL洗涤液A，室温静置20分钟后10000rpm离心10分钟；S6:弃上清，加入1000μL洗涤液B，10000rpm离心10分钟；S7:弃上清，室温干燥5分钟。S8:加入50μLDNA溶解液得到DNA溶液。该对比例中所述洗涤液A和洗涤液B室温配置后直接使用。表4：对比例1及对比例2同时提取3mL羊水DNA浓度及A260/A280数据对比提取对象：羊水平均浓度(ng/μL)平均A260/A280对比例143.62.09对比例236.71.97对比例3提取对象：与实施实例4相同的唾液样本其中裂解液为2mol/L的盐酸胍、2mol/L的硫氰酸胍、5％的Triton-100、0.1％的吐温80及2mmol/L氟苯哌苯醚溶液、其余为去离子水；蛋白酶K溶液浓度为10mg/mL；RNA酶A溶液浓度为30mg/mL；沉淀剂为4mol/L硫酸铵溶液，洗涤液A为95％乙醇，洗涤液B为75％乙醇，DNA溶解液为100mmol/L的Tris-HCl溶液。本对比例的方法与实施实例4所述方法相比，删除步骤S2与步骤S3重悬操作，其余全部相同。表5.实施实例4试剂盒与对对比例3试剂盒同时对2个唾液样本进行提取唾液的DNA浓度及A260/A280、A260/A230数据对比通过图3和表5可以充分看出本发明试剂盒较对比试剂盒在提取唾液细胞DNA过程中，DNA的浓度和纯度有明显优势，添加N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液可以清除唾液样本中痰液粘液，提高唾液DNA提取的产量和纯度。A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A280是蛋白质的吸光度。当前第1页1 2 3