一种梅花鹿鹿皮胶原蛋白的提取方法与流程

本发明属于鹿皮胶原蛋白提取工艺技术领域，具体涉及一种梅花鹿鹿皮胶原蛋白的提取方法。

背景技术：

鹿皮由于鞣制后异常坚韧、柔软，因此无论在服装行业还是在制造擦拭精密仪器等方面都倍受青睐，但是不仅如此，鹿皮中还含有丰富的胶原蛋白。虽然国内外对胶原蛋白的研究已相当广泛，但对于鹿皮中含有的胶原蛋白的研究及提取仍然处于初级阶段，鹿皮中的胶原蛋白能够促进细胞生长，有保持皮肤弹性，延缓肌肤衰老，美容、祛皱等功效，德国研究者表明胶原蛋白中的多肽可以抑制酪氨酸酶的活性，从而有减少色斑的作用。同时胶原蛋白中含有的羟脯氨酸是将血浆中的钙运输到骨细胞的重要载体并使钙质与骨细胞结合。胶原蛋白成为补钙的重要条件之一，并且胶原蛋白能保持血管弹性，防止血栓及血管破裂。胶原蛋白还可以延长分解代谢的过程，燃烧更多的脂肪，从而达到减肥的目的。因此，鹿皮胶原蛋白的提取方法对提取更多更优质的胶原蛋白及对扩展其应用方面具有重要意义。

技术实现要素：

本发明主要对梅花鹿鹿皮中含有的胶原蛋白的提取方法进行研究，发现其可以较为简单的提出胶原蛋白多肽物质(分子量在3kda～20kda的活性物质)。基于这些发现，本发明的目的在于提供更优化的梅花鹿鹿皮胶原蛋白的提取方法，具有提取操作简单、提取率高、环保高效的特点。为日后应用鹿皮胶原蛋白制备功能性食品、开拓鹿皮胶原蛋白的市场前景等打下一定基础。

本发明主要是利用酸水解和酶解联合的方式提取鹿皮中的胶原蛋白，并通过优化消化时间及添加的酶量等条件从而达到能够提取较高浓度的胶原蛋白的目的。

本发明所述的一种梅花鹿鹿皮胶原蛋白的提取方法，其步骤如下：

(1)鹿皮前处理：去除鹿皮上的毛、油脂和粘附组织，用清水反复漂洗至无血色，沥干后将鹿皮切成小条；

(2)脱脂：将步骤(1)产物放入质量分数为10～20％的醋酸水溶液中浸泡5～10天，再用蒸馏水漂洗、沥干；

(3)胶原蛋白的提取：将步骤(2)的产物加蒸馏水定容至200～500ml，匀浆后加纯醋酸至醋酸终浓度为0.5mol/l，再加入1～11ml胃蛋白酶的醋酸溶液，胃蛋白酶醋酸溶液中，胃蛋白酶的浓度为15～30mg/ml；然后在37℃条件下搅拌消化8～52h，再用naoh水溶液调节ph至9～10，随后加入与naoh水溶液等体积的蒸馏水后静置过夜；

(4)用盐酸将步骤(3)得到的反应体系调节ph至3～5，搅拌2～4h，再按终浓度15～25g/l加入经盐酸处理过的硅藻土，然后搅拌、静置、过滤，去除沉淀物，取胶原蛋白上清液，在-45℃～-50℃条件下冷冻干燥，得白色粉末即为梅花鹿鹿皮胶原蛋白。

上述方法中，经盐酸处理过的硅藻土，是用5～20mmol/l盐酸浸泡硅藻土1～3h，用蒸馏水清洗数次得到。

附图说明

图1：实施例2～9bca法蛋白定量结果：消化时间与胶原蛋白浓度的线性关系曲线；定酶量(30mg)优化消化时间，本发明合适的消化时间范围是28～36h，其中消化时间为28h时得到的蛋白浓度最高。

图2：实施例1、实施例10～16bca法蛋白定量结果：酶量与胶原蛋白浓度的线性关系曲线；定时间(28h)优化酶量，其中酶量220mg时得到的胶原蛋白浓度最高。但200mg和220mg酶量的蛋白浓度(13.46mg/ml、13.81mg/ml)差距并不大，可认为220mg为最优酶量，但不计成本条件下也可再适当提高酶量从而达到提高蛋白浓度的目的。本发明合适的酶量范围是200～220mg。

图3：tricine-sds-page凝胶电泳图谱，由于bca法蛋白定量结果28h时蛋白浓度最高，因此围绕28h前后共五个时间点，对胶原蛋白进行分子量分析，从电泳图谱可以看出20kda以下，12h、24h、28h、32h、36h均有较宽的蛋白条带，凝胶底端边缘处也都呈现出较明显的蛋白条带，说明提取的胶原蛋白中有很多较小分子的多肽物质，并且其中28h组相对其他组在凝胶底端有更明显的蛋白聚集，与bca法蛋白定量结果28h时得到的蛋白浓度最高的结果相呼应。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1为酶量、消化时间的最优方案；实施例2～9为相同酶量、不同消化时间制备的胶原蛋白上清液；实施例10～16为相同时间、不同酶量制备的胶原蛋白上清液。

实施例1：

1、将梅花鹿鹿皮剥离后，钉在木板上，用剪刀和刮刀剔除皮上的毛并用刀刮去皮上的油脂和粘附组织；

2、将步骤1处理后的鲜鹿皮用清水反复漂洗至无血色并沥干；

3、将步骤2处理后的鹿皮用斩切机切成1㎝×2㎝的小细条，用质量分数10％的醋酸水溶液浸泡7天；

4、将步骤3得到的去除了皮毛、油脂和角质层的鹿皮，用蒸馏水反复漂洗3次后沥干；

5、取25g步骤4处理得到的鹿皮，加蒸馏水300ml定容至鹿皮的含量为25g/300ml，用组织捣碎机匀浆；

6、向步骤5的反应体系中加入纯醋酸至醋酸浓度为0.5mol/l，组织匀浆；

7、用0.5mol/l醋酸配制胃蛋白酶的醋酸溶液(20mg/ml)，然后将该胃蛋白酶溶液11ml，即质量为220mg的胃蛋白酶，加入到步骤6的组织匀浆中，37℃搅拌消化28h；

8、用10mol/lnaoh水溶液(2.8ml)将步骤7产物的ph调节至9，静置过夜；

9、为了后期便于过滤，向步骤8产物中加入等体积(与步骤8中加入的naoh的体积量相同)的蒸馏水，用1.2ml盐酸调节ph至4，搅拌2h(至此步骤，上述反应体系的体积一共为328.54ml)，得到消化液；

10、用10mmol/l盐酸浸泡硅藻土2h，用蒸馏水清洗数次；然后按浓度20g/l将处理过的硅藻土(即6.57g盐酸处理过的硅藻土)，加入步骤9的消化液中，室温下，搅拌混匀后静置至上清液与沉淀呈明显分层状态；

11、将玻璃纤维滤纸置于布氏漏斗中对步骤10的产物进行过滤，滤出硅藻土及其他沉淀、杂质。如胶原蛋白溶液仍浑浊，可重复过滤一次；

12、收集步骤11过滤得到的胶原蛋白上清液，并用infinite200系列酶标仪测得蛋白浓度为13.81mg/ml。

13、将步骤12得到的上清液用冻干机在-50℃冷冻干燥，从而得到本发明所述的鹿皮胶原蛋白白色粉末14.20g。

实施例2：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为8h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是2.81mg/ml。

实施例3：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为12h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是4.10mg/ml。

实施例4：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为24h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是4.65mg/ml。

实施例5：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为28h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是5.28mg/ml。

实施例6：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7种胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为32h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是5.16mg/ml。

实施例7：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为36h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是5.10mg/ml。

实施例8：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为48h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是5.08mg/ml。

实施例9：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中胃蛋白酶质量为30mg，消化时间为52h，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是3.83mg/ml。

通过实施例5得出最优的消化时间为28h，以此条件进而优化使用酶量进行如下述实施例。

实施例10：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为20mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是4.09mg/ml。

实施例11：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为40mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是7.09mg/ml。

实施例12：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为60mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是7.25mg/ml。

实施例13：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为100mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是9.03mg/ml。

实施例14：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为140mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是9.61mg/ml。

实施例15：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为180mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是11.64mg/ml。

实施例16：

操作及各个条件如实施例1中所述，只是步骤7中消化时间为28h，胃蛋白酶质量为200mg，步骤12得到的上清液中的蛋白浓度是13.46mg/ml。

其中实施例1所给出的条件较其他实施例为最优条件，且得到的蛋白浓度最高(13.81mg/ml)。