本发明属于化合物分离纯化领域，特别涉及一种从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法及应用。
背景技术：
他克莫司(英文：tacrolimus)，是从链霉菌streptomycestsukubaensis中分离出的23元大环内酯类抗生素。化学式：c44h69no12·h2o，3s-[3r[e(1s，3s，4s)]，4s，5r，8s，9e，12r，14r，15s，16r，18s，19s，26ar]]-5，6，8，11，12，13，14，15，16，17，18，19，24，25，26，26a-十六氢-5，19-二羟基-3-[2-(4-羟基-3-甲氧基环已基)-1-甲基乙烯基]-14，16-二甲氧基-4，10，12，18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15，19-环氧-3h-吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环二十三碳烷-1，7，20，21(4h，23h)-四酮－单水合物。纯品他克莫司无色棱状结晶，熔点127～129℃；其易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚，难溶于己烷或石油醚，不溶于水。
以他克莫司为主要原料的药物具有高度免疫抑制活性，主要通过抑制白介素-2(l-2)的释放，达到全面抑制t淋巴细胞的活化以及t辅助细胞依赖b细胞的增生作用；也会抑制如白介素-2、白介素-3及γ-干扰素等淋巴因子的生成与白介素-2受体的表达。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时fk506在治疗特应性皮炎(ad)、系统性红斑狼疮(sle)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。
工业上他克莫司主要通过使用筑波链霉菌(s.tsukubaensis)在30℃条件下好氧发酵得到。在他克莫司发酵液中含有残留的可溶性淀粉、玉米浸渍液、酵母粉和碳酸钙等杂质。另外，他克莫司发酵生产时，会有与其结构极为类似的副产物子囊霉素和双氢他克莫司产生，这两种类似物用色谱和结晶法都很难去除。他克莫司在含水环境中又易向其异构体i/ii转化，这些因素导致了他克莫司分离纯化的难度大、收率低的问题。目前，工业上从发酵液中分离纯化他克莫司一般采用溶剂提取－大孔树脂吸附－溶剂萃取－硅胶柱层析－结晶(或树脂特异性吸附)技术路线。举例说明步骤如下：
a、发酵液通过硅藻土过滤，获得菌丝滤饼和滤液。
b、滤饼用丙酮提取，获得提取液。提取液与第一步的滤液合并。
c、通过装有非离子吸收树脂的柱子。用水和丙酮的水溶液进行梯度洗脱。
d、洗脱液在减压下浓缩后，用乙酸乙酯进行萃取提取。
e、减压浓缩乙酸乙酯溶液获得油状产品。
f、将油状产品吸附在酸性硅胶中，使用正己烷和乙酸乙酯混合液与乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏。
g、重复以上3次，得到白色粉末状产物。
h、产物使用乙腈溶解和重结晶。或使用负载有ag+的配位大孔树脂进行吸附和纯化。
探索快速、高效且具有工业应用价值的分离纯化方法对对提高他克莫司原料品质、生产效率和降低生产成本具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法。
本发明的另一目的在于提供所述的从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法，包括以下步骤：
(1)将筑波链霉菌(s.tsukubaensis)菌丝体与亲水型离子液体混合；常压下惰性气体氛围中或者真空环境下加热搅拌，加热条件为于40～90℃反应0.5～5小时；
(2)步骤(1)反应后的菌丝体－亲水型离子液体溶液与有机溶剂a混合，进行萃取；
(3)使用疏水型离子液体与步骤(2)萃取后的菌丝体－亲水型离子液体溶液混合，常压惰性气体氛围中或者真空环境下加热搅拌，加热条件为于40～90℃反应0.5～5小时，然后静置分层，取疏水相，回收含亲水型离子液体的亲水相；
(4)使用超纯水对步骤(3)的疏水相进行水洗；
(5)对步骤(4)水洗后的疏水相中的他克莫斯成分进行超临界co2萃取，收集萃取物，回收含疏水型离子液体的溶剂；萃取物干燥后用有机溶剂b溶解，得到萃取物溶液；
(6)将液态二氧化碳和步骤(5)的萃取物溶液同时注入超临界co2反应器的顶部，通过雾化的方法喷入反应腔反应；二者在反应腔内充分混合后流过底部的筛板沉淀器，收集聚集在沉淀器的他克莫司结晶，得到他克莫司。
所述的从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法还包括如下步骤：将步骤(3)回收的含亲水型离子液体的亲水相和步骤(5)中回收的含疏水型离子液体的溶剂经过真空干燥和活性炭吸附处理后，分别得到能重复利用的亲水型离子液体和疏水型离子液体。
步骤(1)中所述的菌丝体的含水量不高于50％(w/w)；优选为10～50％(w/w)。
步骤(1)中所述的亲水型离子液体的用量按照菌丝体干重质量：亲水型离子液体质量＝1:2～1:20配比；优选为按照菌丝体干重质量：亲水型离子液体质量＝1:2～1:6配比。
步骤(1)和(3)中所述的常压为1个大气压。
步骤(1)和(3)中所述的惰性气体优选为氮气。
步骤(1)中所述的加热条件优选为于50～90℃反应0.5～2小时。
步骤(2)中所述的亲水型离子液体中的阳离子优选为1-甲基-3-甲基咪唑、1-甲氧基-3-甲基咪唑、1-羧甲基-3-甲基咪唑、1-乙基-3-甲基咪唑、1-乙烯基-3-甲基咪唑、1-羟乙基-3-甲基咪唑、1-乙氧基-3-甲基咪唑、1-羧乙基-3-甲基咪唑、1-乙酸乙酯基-3-甲基咪唑、1-氨乙基-3-甲基咪唑、1-丙基-3-甲基咪唑、1-氨丙基-3-甲基咪唑、1-腈丙基-3-甲基咪唑、1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑、1-戊基-3-甲基咪唑、1-己基-3-甲基咪唑、1-辛基-3-甲基咪唑、1-甲基-2、3-二甲基咪唑、1-甲氧基-2、3-二甲基咪唑、1-羧甲基-2、3-二甲基咪唑、1-乙基-2、3-二甲基咪唑、1-乙烯基-2、3-二甲基咪唑、1-羟乙基-2、3-二甲基咪唑、1-乙氧基-2、3-二甲基咪唑、1-羧乙基-2、3-二甲基咪唑、1-乙酸乙酯基-2、3-二甲基咪唑、1-氨乙基-2、3-二甲基咪唑、1-丙基-2、3-二甲基咪唑、1-氨丙基-2、3-二甲基咪唑、1-腈丙基-2、3-二甲基咪唑、1-烯丙基-2、3-二甲基咪唑、1-丁基-2、3-二甲基咪唑、1-戊基-2、3-二甲基咪唑、1-己基-2、3-二甲基咪唑和1-辛基-2、3-二甲基咪唑中的一种或至少两种；更优选为1-丙基-3-甲基咪唑、1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑和1-戊基-3-甲基咪唑中的至少一种。
步骤(2)中所述的亲水型离子液体中的阴离子优选为氯、溴、碘、四氟硼酸、醋酸、硝酸、高氯酸、硫酸氢、磷酸二氢、三氟甲烷磺酸、三氟乙酸和对甲苯磺酸中的一种或至少两种；优选为氯和醋酸中的一种或两种。
步骤(2)中所述的有机溶剂a为己烷和石油醚中的一种或两种。
所述的己烷优选为正己烷。
步骤(2)中所述的有机溶剂a的用量优选为所述的菌丝体－亲水型离子液体溶液与所述的有机溶剂a按体积比2:1～1:10配比；
步骤(2)中所述的萃取是在室温下萃取。
所述的室温为10～30℃；优选为20～30℃。
步骤(3)中所述的疏水型离子液体中的阳离子优选为1-癸基-3-甲基咪唑、1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-十四烷基-3-甲基咪唑、1-十六烷基-3-甲基咪唑、1-十八烷基-3-甲基咪唑、1-乙基-2,3-二甲基咪唑、1-己基-2，3-二甲基咪唑和1-十六烷基-2，3-二甲基咪唑中的一种或至少两种；优选为1-癸基-3-甲基咪唑、1-十四烷基-3-甲基咪唑和1-十六烷基-2，3-二甲基咪唑中的一种或至少两种。
步骤(3)中所述的疏水型离子液体中的阴离子优选为溴、磺酸、六氟磷酸和双三氟甲烷磺酰亚胺中的一种或至少两种。
步骤(3)中所述的疏水型离子液体的用量优选为所述的疏水型离子液体与所述的萃取后的菌丝体－亲水型离子液体溶液按质量比10:1～1:10配比；优选为按质量比5:1～1:2配比。
步骤(3)中所述的加热条件优选为于50～90℃反应0.5～3小时。
步骤(3)中所述的静置分层优选为冷却至30℃再静置分层。
上述的离子液体是通过人工合成的化合物，阳离子和阴离子可以通过需要进行自由组合。这些离子液体可以通过商业途径合成，如兰州中科凯特科工贸有限公司。
步骤(4)中所述的水洗的条件优选为在20～60℃条件下进行水洗；更优选为在40～60℃条件下进行水洗。
步骤(4)中所述的超纯水的每次用量优选为相当于所述的疏水相的1～10倍体积；优选为相当于所述的疏水相的2～5倍体积。
步骤(4)中所述的水洗的次数优选为2～3次。
步骤(5)中所述的超临界co2萃取的萃取条件优选为：co2用量与疏水相按质量比3～20:1配比；萃取体系的压强为9～30mpa，萃取的温度为35～60℃，按相当于二氧化碳质量0～5％(w/w)的量添加挟带溶剂，出口温度35～55℃，流速0.1～1l/min；更优选为：co2用量与疏水相按质量比3～15:1配比；萃取体系的压强为10～30mpa，萃取的温度为40～55℃，按相当于二氧化碳质量0.5～1％(w/w)的量添加挟带溶剂，出口温度40～55℃，流速0.3～1l/min。
步骤(5)中所述的超临界co2萃取中所使用的挟带溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和乙醚中的一种或至少两种。
步骤(5)中所述的超临界co2萃取中所使用的萃取物收集溶剂优选为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、二甲基亚砜和乙腈中的一种或至少两种。
步骤(5)中所述的有机溶剂b优选为二甲基亚砜或乙腈。
步骤(5)中所述的萃取物溶液的浓度为0.5％～30％(w/w)；优选为10～15％(w/w)。
步骤(6)中所述的液态二氧化碳为高压液体二氧化碳。
步骤(6)中所述的液态二氧化碳和所述的萃取物溶液按1～20：1(m/v，g：ml)配比混合；优选为按质量体积比8～10:1配比混合。
步骤(6)中所述的通过雾化的方法喷入反应腔反应中的反应条件优选如下：反应体系压强为10～50mpa，温度为40～65℃，流速为0.5～2l/min；更优选如下：反应体系压强为10～45mpa，温度为40～60℃，流速为0.8～1.5l/min。
所述的从菌丝体中分离纯化他克莫司的方法适合用于工业上分离纯化得到他克莫司。
本发明的原理：离子液体是在室温和室温附近温度下呈液体状态的盐类物质，通常由有机阳离子和无机阴离子或者有机阴离子组成。离子液体有很多特点：液态温度范围广，可达到几百度；具有很高的稳定性；蒸汽压低、几乎不挥发；具有类似有机溶剂的性质，对许多有机物和无机物有很好的溶解性能。离子液体非常适合作为分离提纯的介质，尤其是在液-液提取分离上：离子液体能溶解某些有机化合物、无机化合物和有机金属化合物，而同有机或无机溶剂不混溶。离子液体的独特性质通常是由其特定的结构和离子间的作用力决定。根据离子液体阳离子和阴离子基团的种类的不同，离子液体可分为亲水和疏水两种类型。其中阴离子为cl－和oac－等咪唑类亲水型的离子液体具有高效溶解纤维素和丝状真菌细胞壁的能力。在该类离子液体中，s.tsukubaensis细胞壁的溶解可以有效释放菌丝内代谢产物。疏水型离子液体主要包含阳离子为取代基链长超过8个碳原子的咪唑类，阴离子为六氟磷酸根和三氟甲基磺酰胺的离子液体。疏水型离子液体与水、亲水型的离子液体和其他极型溶剂混合不易互溶。疏水型并且具有相同咪唑阳离子、不同阴离子的离子液体通过共混可以改变其的疏水性和对他克莫司成分的亲和性，以达到对于此体系最优化的萃取效果。相对常规机械破碎法和有机溶剂溶解的方法，使用离子液体进行提取和萃取具有高效和低毒的特点。
溶解在亲水型离子液体中的菌丝体及其内容物先经过己烷或石油醚进行萃取，除去脂肪和脂肪酸等成分。然后采用疏水型离子液体－亲水型离子液体两相萃取的方法，将他克莫司等成分转移到疏水离子液体相中，实现与发酵液和菌丝中极型杂质的分离。收集的疏水相通过水洗，残留的水溶性物质(糖、蛋白和氨基酸、维生素等)被除掉。离子液体具有极低的饱和蒸汽压，几乎不挥发。溶解在疏水型离子液体中的非挥发性的成分(例如他克莫司)可通过超临界co2萃取的方法进行分离。超临界co2具有超强的渗透力和溶解力，可以完全溶解在离子液体中，而离子液体并不溶解在co2中。控制反应体系压强、温度和夹带溶剂，可以实现分离和富集他克莫司原料产品。该方法相对于常规的蒸馏、蒸发浓缩和层析等方法更为简单和高效。使用超临界结晶技术的气体抗溶剂效应可以进一步对他克莫司产品进行纯化。气体抗溶剂效应是指在高压条件下溶解的co2使有机溶剂膨胀，内聚能显着降低，溶解能力减小，使已溶解的物质形成结晶或无定型沉淀的过程。根据气体抗溶剂效应对温度和反应体系压强敏感的特性，超临界流体结晶技术能够保持物质的天然结构和活性的情况下制备和纯化超细晶体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明对他克莫司的回收率高，为70～85％；纯度也高，为90％以上，高达99％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、筑波链霉菌strptomycesgw-2-1920-1916-02(广东省微生物种质资源库)菌丝体通过液体深层发酵的方法获得，具体步骤如下：液体发酵培养基(重量比)含有1.5％葡萄糖，1.5％可溶性淀粉，0.1％l-赖氨酸，0.1％(nh4)2so4,0.05％k2hpo4和mgso4，0.005％vb1，ph＝6.5。30℃下发酵72h后过滤收集菌丝体。收集的筑波链霉菌菌丝体(含水量为10％(w/w))，与亲水型离子液体1-丙基-3-甲基咪唑氯盐按照比例为1:3(干重w/w)混合。常压n2氛围下加热搅拌，加热温度为50℃，反应时间2小时。
2、第1步反应后的菌丝体－离子液体溶液与正己烷按照1:5(v/v)比例混合，室温下进行萃取。
3、使用疏水型离子液体溴化1-癸基-3-甲基咪唑与第2步萃取后的菌丝体－离子液体溶液按照2:1(w/w)比例混合，常压n2氛围加热(50℃)机械搅拌反应2小时后冷却至30℃静置分层。
4、使用3倍体积的超纯水对第3步中的疏水相在40℃下进行水洗3次。
5、对水洗后的疏水相进行超临界co2萃取。co2使用量与疏水相比为3:1(w/w)，萃取体系压强10mpa，萃取温度40℃，挟带溶剂为乙醇，添加量为0.5％(w/w)，出口温度40℃，流速0.3l/min，萃取物收集溶剂为乙醇。
6、萃取物真空干燥后溶于乙腈中，浓度为10％(w/w)。
7、将高压液态二氧化碳和步骤6中的萃取物溶液按质量体积比10:1比例经共同注入超临界二氧化碳反应器的顶部的雾化喷嘴，反应体系压强10mpa，温度40℃，流速1l/min。在反应器底部的筛板模块上收集他克莫司结晶。
计算和分析他克莫斯的成分的回收率为75％，纯度95％。
回收率的＝(该分离方法得到的他克莫斯成分的质量/菌丝体中他克莫斯总含量)×100％。
纯度＝(该分离方法得到的结晶中他克莫斯成分质量/结晶质量)×100％
实施例2
1、按实施例步骤1，通过液体深层发酵的方法获得含水量20％的筑波链霉菌strptomycesgw-2-1920-1916-02菌丝体，将获得的菌丝体与亲水型离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐按照比例为1:6(干重w/w)混合。常压下n2氛围下加热搅拌，加热温度为70℃，反应时间1小时。
2、第1步反应后的菌丝体－亲水型离子液体溶液与石油醚按照1:1(v/v)比例混合，室温下进行萃取。
3、使用疏水型离子液体1-己基-2，3-二甲基咪唑六氟磷酸盐与第2步萃取后的菌丝体－亲水型离子液体溶液按照5:1(w/w)比例混合，常压n2氛围下加热(70℃)机械搅拌反应3小时后冷却至30℃静置分层。
4、使用5倍体积的超纯水对第3步中的疏水相在50℃下进行水洗3次。
5、对水洗后的疏水相进行超临界co2萃取，收集萃取物。co2使用量与疏水相比为10:1(w/w)，萃取体系压强25mpa，萃取温度50℃，出口温度45℃，流速0.8l/min，挟带溶剂为乙酸乙酯，添加量为0.8％(w/w)。萃取物收集溶剂为乙酸乙酯。
6、萃取物真空干燥后溶于乙腈中，浓度为15％(w/w)。
7、将高压液态二氧化碳和步骤6中的萃取物溶液按质量体积比9:1比例经共同注入超临界二氧化碳反应器的顶部的雾化喷嘴，反应体系压强30mpa，温度55℃，流速0.8l/min。在反应器底部的筛板模块上收集他克莫司结晶。
计算和分析他克莫斯的成分的回收率为85％，纯度92％。
实施例3
1、按实施例步骤1，通过液体深层发酵的方法获得含水量50％的筑波链霉菌strptomycesgw-2-1920-1916-02菌丝体，将获得的菌丝体与亲水型离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐和1-戊基-3-甲基咪唑氯盐的混合物(1:1，v/v)按照比例为1:2(干重w/w)混合。常压下真空下加热搅拌，加热温度为90℃，反应时间0.5小时。
2、第1步反应后的菌丝体－亲水型离子液体溶液与正己烷按照2:1(v/v)比例混合，室温下进行萃取。
3、使用疏水型离子液体为1-十二烷基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与第2步萃取后的菌丝体－亲水型离子液体溶液按照1:2(w/w)比例混合，真空加热(90℃)机械搅拌0.5小时后，冷却至30℃静置分层。
4、使用5倍体积的超纯水对第3步中的疏水相在60℃下进行水洗2次。
5、对水洗后的疏水相进行超临界co2萃取，收集萃取物。co2使用量与疏水相比为15:1(w/w)，萃取体系压强30mpa，萃取温度55℃，出口温度55℃，流速1l/min，挟带溶剂为丙酮，添加量为1％(w/w)，萃取物收集溶剂为丙酮。
6、萃取物真空干燥后溶于二甲基亚砜，浓度为5％(w/w)。
7、将高压液态二氧化碳和步骤6中的萃取物溶液按质量体积比8:1比例经共同注入超临界二氧化碳反应器的顶部的雾化喷嘴。反应体系压强45mpa，温度60℃，流速1.5l/min。在反应器底部的筛板模块上收集他克莫司结晶。
计算和分析他克莫斯的成分的回收率为70％，纯度99％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。