一种明胶微球及其制备方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种明胶微球及其制备方法。
背景技术：
：明胶是天然来源、生物相容性良好的高分子材料，是胶原蛋白经温和而不可逆降解得到的产物。明胶中含有角蛋白、弹性硬蛋白、黑素和软骨素，可以促进细胞的黏附和生长，这是明胶可作为细胞扩增微载体的一个重要因素。温度降至40℃左右时，明胶会发生由自由卷曲向螺旋型构象的转变，因此明胶不能直接在生理条件下使用，要想作为细胞扩增载体，则必须进行适当的交联。目前，常用的醛类交联剂(如戊二醛)对细胞存在一定的毒副作用，不利于细胞的扩增。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种明胶微球及其制备方法，本发明提供的明胶微球在细胞扩增培养过程中能减少对细胞的毒性，提高细胞活性，且降解效果较好。本发明提供一种明胶微球的制备方法，包括以下步骤：a)将明胶溶于水中，加热溶解，加入溶有乳化剂a的油相进行搅拌，再加入乳化剂b进行搅拌，迅速冷却，再次搅拌，得到乳浊液。b)在所述乳浊液中加入脱水剂a进行脱水，再加入脱水脱油剂b和脱水脱油剂c交替清洗明胶微球，最后用无水乙醇清洗，烘干、过筛后，得到明胶微球粗品。c)在所述明胶微球粗品中加入含有京尼平交联固化剂的乙醇溶液，放置一段时间后，吸取上清液，依次经过清洗、烘干，得到明胶微球。优选的，步骤a)所述乳化剂a为液体石蜡、蓖麻油、橄榄油，花生油，大豆油、可可豆脂、椰油醋、棕搁油醋、乙酸乙酯、蜂蜡以及硅油中的任意一种或几种。优选的，步骤a)所述乳化剂b为液体石蜡、蓖麻油、橄榄油，花生油，大豆油、可可豆脂、椰油醋、棕搁油醋、乙酸乙酯、蜂蜡以及硅油中的任意一种或几种。优选的，其特征在于，步骤b)所述脱水剂a为无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、正丁醇以及叔丁醇中的任意一种。优选的，步骤b)所述脱水脱油剂b为无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、二恶烷、正丁醇、叔丁醇中的任意一种。优选的，步骤b)所述脱水脱油剂c为无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、二恶烷、正丁醇、叔丁醇中的任意一种。优选的，步骤c)所述京尼平交联固化剂在乙醇溶液中的质量体积比为0.25％～1％。优选的，步骤c)所述明胶微球粗品的粒径为75～300μm。本发明还提供一种明胶微球，通过上述任意一项所述制备方法制备得到。与现有技术相比，本发明提供一种明胶微球及其制备方法。本发明提供的明胶微球的制备方法中加入了京尼平交联固化剂。天然来源的京尼平(genipin)是一类氨基多糖/蛋白质的良好交联剂，其对细胞的毒害作用明显小于戊二醛，在细胞扩增培养过程中能减少对细胞的毒性，提高细胞活性，且降解效果较好。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1示细胞贴壁明胶微球1示意图；图2示细胞贴壁明胶微球2示意图；图3示细胞贴壁明胶微球3示意图；图4示细胞贴壁明胶微球4示意图；图5示明胶微球1降解情况示意图；图6示明胶微球2降解情况示意图；图7示明胶微球3降解情况示意图；图8示明胶微球4降解情况示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供了一种明胶微球的制备方法，包括以下步骤：首先，将明胶溶于水中。所述明胶用量优选为10％-20％w/v。溶于水后进行加热溶解。所述加热优选为70℃-100℃。加入溶有乳化剂a的油相进行搅拌。所述乳化剂a优选为液体石蜡、蓖麻油、橄榄油，花生油，大豆油、可可豆脂、椰油醋、棕搁油醋、乙酸乙酯、蜂蜡以及硅油中的任意一种或几种，更优选为液体石蜡、乙酸乙酯、橄榄油，花生油，大豆油中的任意一种或几种。明胶体积与乳化剂a的体积比优选为1～5:1，以一定的速度进行搅拌，所述速度优选为100r/min～900r/min，搅拌后再加入乳化剂b进行搅拌。所述乳化剂b优选为液体石蜡、蓖麻油、橄榄油，花生油，大豆油、可可豆脂、椰油醋、棕搁油醋、乙酸乙酯、蜂蜡以及硅油中的任意一种或几种，更优选为液体石蜡、乙酸乙酯、橄榄油，花生油，大豆油中的任意一种或几种。所述乳化剂b的添加量为明胶微球与乳化剂b的体积比是1:1～5。随后将乳浊液冰水浴迅速冷却至5℃以下，以一定的速度继续搅拌一段时间，得到乳浊液。所述搅拌的速度优选为100r/min～450r/min。然后，在所述乳浊液中加入-20℃冰浴的脱水剂a进行脱水。所述脱水剂的加入量为乳浊液体积的2～5倍。脱水结束后，再加入脱水脱油剂b和脱水脱油剂c交替清洗明胶微球。所述脱水脱油剂b优选为无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、二恶烷、正丁醇、叔丁醇的一种，更优选为异丙醇、丙酮、二恶烷。所述脱水脱油剂c优选为无水乙醇、异丙醇、丙酮、甘油、二恶烷、正丁醇、叔丁醇的一种，更优选为异丙醇、丙酮、二恶烷。最后用无水乙醇再次进行洗涤，放置一定温度下烘干，得到明胶微球颗粒。所述烘干温度优选为60℃～80℃。烘干后将所述明胶微球进行过筛。所述过筛用的筛网尺寸分别为75μm，160μm，200μm，300μm。过筛后得到不同粒径的明胶微球粗品。最后，选取一定粒径的明胶微球粗品，加入含有京尼平交联固化剂的乙醇溶液。所述明胶微球的粒径优选为75μm～300μm。所述含有京尼平交联固化剂的乙醇溶液的添加量为明胶微球粗品体积的2～5倍，所述京尼平交联固化剂在溶液中的质量体积比为0.25％～1％。在4℃下放置20～30h，随后在37℃放置36～40h，吸弃上清液。再加入无水乙醇清洗2-3次，烘干，得到明胶微球。所述无水乙醇的添加量优选为明胶微球粗品的2～5倍。本发明还提供一种明胶微球，通过上述明胶微球的制备方法制备得到。与现有技术相比，本发明提供一种明胶微球及其制备方法。本发明提供的明胶微球的制备方法中加入了京尼平交联固化剂。天然来源的京尼平(genipin)是一类氨基多糖/蛋白质的良好交联剂，具有独特的明胶交联机理，京尼平上的烯碳原子受到明胶上氨基的亲核攻击，开环形成杂环胺化合物，其对细胞的毒害作用明显小于戊二醛。在细胞扩增培养过程中能减少对细胞的毒性，提高细胞活性，且降解效果较好。目前京尼平作为生物交联剂在生物医学领域已经得到了广泛研究和应用，成功地应用于人造生物敷料、组织工程眼角膜、食管、气管、关节软骨等各个方面。京尼平交联的脱细胞牛心包膜比戊二醛交联效果具有更好的生物相容性，且细胞毒性低，组织稳定性高，更加适合作为瓣膜组织工程支架材料。京尼平含有羟基、羧基等多个活性官能团，因此可用于多种天然生物材料的交联，其形成的交联产物具有稳定、抗炎、促进组织再生的特点。为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1制备明胶微球(1)称量5g明胶，溶于超纯水50ml中，在70℃下加热完全溶解。明胶溶液搅拌加入溶有乳化剂液体石蜡的油相中。明胶体积与乳化剂液体石蜡的体积比是5:1，以900r/min的速度搅拌，形成乳浊液。再加入乳化剂橄榄油，形成第二层油相。明胶体积与乳化剂橄榄油的体积比是1:2，随即以450rpm的速度搅拌1min。(2)将乳浊液冰水浴使其速冷却到5摄氏度以下，450rpm的速度继续搅拌30min，再加入2倍该乳浊液体积的-20℃冰浴的脱水脱油剂无水乙醇，搅拌脱水。再用脱水脱油试剂异丙醇、丙酮交替清洗明胶微球，最后选用无水乙醇洗涤明胶微球，放置80℃烘干。明胶微球颗粒分别用75μm，300μm筛网依次过筛。(3)选择75μm～300μm的大小的明胶微球，加入5倍体积的含有0.25％交联剂金尼平的无水乙醇溶液。放置4℃30h，随后在37℃放置36小时。吸弃上清，将明胶微球用5倍体积的无水乙醇清洗2-3次，100摄氏度烘干即得明胶微球1。实施例2制备明胶微球(1)称量5g明胶，溶于超纯水50ml中，在在70℃加热完全溶解。明胶溶液搅拌加入溶有乳化剂乙酸乙酯的油相中。明胶体积与乳化剂乙酸乙酯的体积比是2:1，以900r/min的速度搅拌，形成乳浊液。再加入乳化剂大豆油，形成第二层油相。明胶体积与乳化剂大豆油的体积比是1:3。随即以450rpm的速度搅拌1min。(2)随后将乳浊液冰水浴迅速冷却到5摄氏度以下，450rpm的速度继续搅拌30min.再加入2倍该乳浊液体积的-20℃冰浴的脱水脱油剂异丙醇，搅拌脱水。再用脱水脱油试剂异丙醇、丙酮交替清洗明胶微球，最后选用无水乙醇洗涤明胶微球，放置80℃烘干。明胶微球颗粒分别用75μm，300μm筛网依次过筛.(3)选择75μm-300μm的大小的明胶微球，加入5倍体积的含有0.6％交联剂金尼平的无水乙醇溶液。在4℃下放置20h，随后在37℃放置30小时。吸弃上清，将明胶微球用5倍体积的无水乙醇清洗2-3次，100摄氏度烘干即得明胶微球2。实施例3制备明胶微球(1)称量10g明胶，溶于超纯水50ml中，在在70℃加热完全溶解。明胶溶液搅拌加入溶有乳化剂乙酸乙酯的油相中。明胶体积与乳化剂乙酸乙酯的体积比是1:1，以900r/min的速度搅拌，形成乳浊液。再加入乳化剂大豆油，形成第二层油相。明胶体积与乳化剂花生油的体积比是1:3.随即以200rpm的速度搅拌1min。(2)随后将乳浊液冰水浴迅速冷却到5摄氏度以下，450rpm的速度继续搅拌30min.再加入2倍该乳浊液体积的-20℃冰浴的脱水脱油剂异丙醇，搅拌脱水。再用脱水脱油试剂二恶烷、异丙醇交替清洗明胶微球，最后选用无水乙醇洗涤明胶微球，放置80℃烘干。明胶微球颗粒分别用75μm，300μm筛网依次过筛。(3)选择75μm-300μm的大小的明胶微球，加入5倍体积的含有1％交联剂金尼平的90％乙醇溶液。放置4℃20h，随后在37℃放置30小时。吸弃上清，将明胶微球用5倍体积的无水乙醇清洗2-3次，100摄氏度烘干即得明胶微球3。实施例4对比例(1)称量10g明胶，溶于超纯水50ml中，在在70℃加热完全溶解。明胶溶液搅拌加入溶有乳化剂乙酸乙酯的油相中。明胶体积与乳化剂乙酸乙酯的体积比是1:1，以900r/min的速度搅拌，形成乳浊液。再加入乳化剂大豆油，形成第二层油相。明胶体积与乳化剂花生油的体积比是1:3。(2)随即以200rpm的速度搅拌1min。随后将乳浊液冰水浴迅速冷却到5摄氏度以下，450rpm的速度继续搅拌30min。加入戊二醛至其含量为10％，交联固化3小时，再加入2倍该乳浊液体积的-20℃冰浴的脱水脱油剂异丙醇，搅拌脱水。再用脱水脱油试剂二恶烷、异丙醇交替清洗明胶微球.(3)最后选用无水乙醇洗涤明胶微球，放置80℃烘干。明胶微球颗粒分别用75μm，300μm筛网依次过筛，得到对照组明胶微球4。实施例5使用明胶微球扩增干细胞将实施例1～4制备的明胶微球经过高温高压灭菌后，用dmem/f12基础培养基水化，放置在37℃活化过夜。接种uc-mscsp2脐带间充质干细胞混合，用dmem/f12+10％fbs培养基接种在24孔板中，静止放置37℃，5％co2培养箱，共培养48小时，得到细胞悬液。实施例6dapi染色检测细胞贴壁明胶微球情况取实施例1～4明胶微球悬液，吸弃上清，加入dapi染色15秒，pbs清洗2次后，在荧光显微镜上拍照观察细胞贴壁明胶微球的情况，图1～图4示细胞分别贴壁明胶微球1～4。结果表明(表1，细胞有贴壁明胶微球为+，无细胞贴壁明胶微球的为—)，使用明胶微球1、明胶微球2、明胶微球3的细胞贴壁效果较好，对比例明胶微球4贴壁效果一般。表1细胞贴壁结果明胶微球1明胶微球2明胶微球3明胶微球4细胞贴壁++++++++++实施例7明胶微球降解后细胞活力的检测取实施例1～4明胶微球悬液，吸取上清，用pbs清洗明胶微球2-3次后，加入0.25％胰酶-edta，重悬明胶微球，放置在37摄氏度孵育15-30min，每10min震荡一次，直至明胶微球完全降解，加入fbs中止消化，以1000rpm离心细胞悬液5min，吸弃上清，用dmem/f12+10％fbs完全培养基重悬沉淀，将细胞悬液进行台盼蓝，进行细胞活力检测。表2细胞活力检测明胶微球1明胶微球2明胶微球3明胶微球4细胞活力90.2％85％89.5％80％由表2可知，明胶微球1、2、3培养后的细胞活力均能达到85％以上，明胶微球1、2、3之间细胞活力无差异(p>0.5)，细胞能保持良好活力，由于交联剂戊二醛具有毒副作用，对比例明胶微球4培养后的细胞活力仅达到80％，明胶微球1、2、3与对比例明胶微球4的细胞活力存在差异(p<0.05)，细胞活力较差。实施例8明胶微球的降解取实施例1～4制备的明胶微球，加入0.25％胰酶-edta，混匀后，重悬明胶微球，放置在37摄氏度孵育30min，每10min震荡一次，加入fbs中止消化，在镜下观察明胶微球颗粒降解情况并统计颗粒数。表3明胶微球降解剩余颗粒明胶微球1明胶微球2明胶微球3明胶微球4颗粒数002>200降解效果如图5～图8显示，明胶微球1、2、3降解效果较好，基本无残余颗粒，明胶微球4仍有大量残余。从表3可知，明胶微球1、2、3之间无差异(p>0.05)，而明胶微球1、2、3与对比例明胶微球4之间，存在明显差异(p<0.01)。以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12