一种离液剂以及使用该离液剂提取基因组DNA的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种快速分离组蛋白与基因组dna的离液剂，以及提取dna的方法。

背景技术：

对包括人在内的真核生物而言，一个生物体的基因组dna是指包含在该生物的dna中的全部遗传信息。基因组dna和组蛋白通过非共价键结合在一起，因此，如何将dna和组蛋白进行分离，这是基因组dna提取过程中的关键及难点所在。事实上，不同的基因组dna提取方法，前期样本预处理（细胞裂解）及后期dna的沉淀、洗涤等步骤大同小异，不同方法的核心差异在于如何将dna和组蛋白进行有效分离。

蛋白酶k法是最经典的方法，该方法利用蛋白酶k来降解组蛋白，从而释放出基因组dna。该方法的劣势在于：（1）蛋白酶k的孵育温度为50至65℃，需要额外的加热设备。（2）蛋白酶k对组蛋白的消化需要时间，常需0.5h-过夜，实验用时长。（3）随着放置时间的延长和反复冻融次数的增加，蛋白酶k的酶活会下降，实验重复性和稳定性较差。

为了规避蛋白酶k法的劣势，实际应用中常采用离液剂来分离组蛋白和基因组dna。离液剂可以打破组蛋白和基因组dna之间的非共价作用力（氢键，偶极-偶极相互作用力，疏水相互作用力），使组蛋白发生可逆性变性，从而释放基因组dna，实现基因组dna提取的目的。基因组dna提取中常见的离液剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、高氯酸钠、高氯酸锂。其中盐酸胍和硫氰酸胍法所用的试剂浓度高，高氯酸钠和高氯酸锂法所用试剂浓度虽然较低，但高氯酸盐中氯元素的化合价高，为+7价，试剂氧化性强。

技术实现要素：

本发明的目的是克服蛋白酶k法和高氯酸盐法的缺陷，提供一种快速分离组蛋白与基因组dna的离液剂，以及提取dna的方法。

离液剂是一类能打破组蛋白和基因组dna之间的非共价作用力的化合物，其能使组蛋白发生可逆性变性，从而释放基因组dna，实现基因组dna提取的目的。

本发明提供了一种离液剂，其特征在于，所述离液剂含有溴酸盐。

优选的，所述溴酸盐为溴酸钠。

将含有组蛋白及基因组dna的样本与所述离液剂混匀后，所述溴酸钠的终浓度为0.1-3mol/l。

优选的，将含有组蛋白及基因组dna的样本与所述离液剂混匀后，所述溴酸钠的终浓度为0.2-3mol/l。

更优选的，将含有组蛋白及基因组dna的样本与所述离液剂混匀后，所述溴酸钠的终浓度为1-3mol/l。

本发明还提供了一种使用所述离液剂提取基因组dna的方法，所述dna在提取前结合在组蛋白中；其中，该方法包括如下步骤：

（1）将样本分散成细胞悬液，加入细胞裂解液使细胞破裂，释放出细胞核内的组蛋白与基因组dna的复合物；

（2）将步骤（1）得到的物料与所述离液剂混合均匀，得到组蛋白与基因组dna分离后的物料；

（3）将步骤（2）得到的物料与蛋白抽提液混合均匀，离心，分离得到蛋白被抽提后的上清液；

（4）将所述经蛋白被抽提后的上清液与dna沉淀剂混合，离心后得到dna沉淀。

该方法还包括，将所述dna沉淀进行洗涤和再溶解。

通过上述技术方案，本发明以化学物质溴酸钠（nabro3）替代蛋白酶k来解离组蛋白和基因组dna，这种方法具有以下优点：（1）无需使用蛋白酶k，避免加热并需不时混匀等环节，操作简单，且无需加热设备。（2）避免蛋白酶k长时间消化，节省了操作时间。（3）利用化学试剂处理样本，避免蛋白酶k消化不充分的劣势，快速、充分地分离组蛋白和dna，dna得率高、纯度高。（4）避免蛋白酶k活性易变化的缺陷，重复性好，稳定性高。与传统蛋白酶k消化法相比，本发明能高效、快速、简便地提取包括人类在内的真核生物基因组dna。

与高氯酸钠或高氯酸锂法相比，本发明的方法提取的基因组dna纯度和浓度相当，但所用离液剂的卤素化合价更低（+5价），试剂氧化性较弱。所提取dna的纯度和浓度能满足pcr基因扩增、芯片分析、分子克隆、基因（组）测序/检测等分子生物学相关实验需求。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是溴酸钠法（nabro3法）和蛋白酶k法（消化40min）分别提取唾液法和口腔拭子法采集口腔粘膜上皮细胞dna的电泳检测结果。

图2是溴酸钠法（nabro3法）和蛋白酶k法（仅消化5min）分别提取唾液法采集口腔粘膜上皮细胞dna的电泳检测结果。

图3是不同浓度的溴酸钠和1mol/l的高氯酸钠分别提取人血液白细胞dna的电泳检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种离液剂，该离液剂是能打破组蛋白和基因组dna之间的非共价作用力的化合物，其能使组蛋白发生可逆性变性，从而释放基因组dna，实现基因组dna提取的目的。

其中，将含有组蛋白及基因组dna的样本与离液剂混匀后，溴酸钠的终浓度为0.1-3mol/l，优选为0.2-3mol/l，更优选为1-3mol/l。

另一方面，本发明还提供了一种提取dna的方法，所述dna在提取前与组蛋白结合；其中，该方法包括如下步骤：（1）将样本分散成单细胞悬液，加入细胞裂解液使细胞破裂，释放出细胞核内的组蛋白与基因组dna的复合物；（2）将细胞裂解液与离液剂混合均匀，得到组蛋白与基因组dna分离后的物料；（3）将（2）所述物料与蛋白抽提液混合均匀，离心，分离得到蛋白被抽提后的上清液；（4）将所述经蛋白被抽提后的上清液与dna沉淀剂混合，离心后得到dna沉淀；其中，所述离液剂含有溴酸钠。

其中，作为本发明的一种优选实施方式，所述含有组蛋白及基因组dna的样本中含有细胞裂解液。

其中，该方法还可以进一步包括：将真核生物材料进行预处理，以获得适合直接用于裂解的、含组蛋白和基因组dna的生物材料。所述预处理的操作包括清洗、干燥、剪碎、研磨、冷冻和冻融中的至少一种。可以按照本领域的常规方式进行预处理操作，例如按照《分子克隆实验指南》中记载的内容进行操作。

其中，所述真核生物材料可以包括组织、器官、个体和共生体中的至少一种。所述生物材料可以包括口腔粘膜上皮细胞、血液和人工培养细胞中的至少一种。

其中，该方法还包括：将所述dna进行沉淀、洗涤和再溶解。其中，基因组dna沉淀所用的试剂可以为2-2.5倍体积的95%乙醇或无水乙醇、等体积的异丙醇；进行洗涤所用的洗涤液可以为60-80体积%浓度的乙醇水溶液；进行再溶解所用的溶剂可以为水或te缓冲液。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

实施例1：

本实施例用于说明利用两种不同方法从唾液样品中提取dna的操作。

(1)样品预处理：将唾液2000g离心10min，弃上清，用1ml的生理盐水悬浮口腔粘膜上皮细胞，再2000g离心10min，弃上清。

(2)往eppendorf（ep）管中加入400μl的细胞裂解液,充分混匀至无明显的细胞团。其中细胞裂解液配方为：10mmol/ltris-hcl(ph8.0)，30mmol/ledta(ph8.0)，0.5%sds，rnasea(20μg/ml)。

(3)分别采用蛋白酶k法和溴酸钠法来提取基因组dna。蛋白酶k法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶k，充分混匀，56℃放置40min，期间不时混匀。溴酸钠法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为1mol/l的离液剂溴酸钠，充分混匀。其余步骤相同。

(4)向步骤(3)的ep管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的ep管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将上清转移至另一洁净的ep管中；

(5)向步骤(4)的ep管中加入2.5倍体积的无水乙醇，其中蛋白酶k组需要先加1/10体积的naac（3mol/l，ph5.2），-20℃放置20min，离心收集基因组dna；

(6)向步骤(5)的ep管中加入1ml的70％乙醇洗涤dna，去上清，敞口晾干基因组；

(7)向步骤(6)的ep管中加入100µlte缓冲液，溶解基因组dna沉淀。利用光密度测定法测定基因组dna的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。

实施例2：

本实施例用于说明利用两种不同方法从口腔拭子法采集的口腔粘膜上皮细胞中提取dna的操作。

(1)样品预处理：将携带有口腔粘膜上皮细胞的材料剪下，置于eppendorf（ep）管中。

(2)往ep管中加入400μl的细胞裂解液,充分混匀至无明显的细胞团。其中细胞裂解液配方为：10mmol/ltris-hcl(ph8.0)，30mmol/ledta(ph8.0)，0.5%sds，rnasea(20μg/ml)。

(3)分别采用蛋白酶k法和溴酸钠法来提取基因组dna。蛋白酶k法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶k，充分混匀，56℃放置40min，期间不时混匀。溴酸钠法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为1mol/l的离液剂溴酸钠，充分混匀。其余步骤相同。

(4)向步骤(3)的ep管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的ep管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将上清转移至另一洁净的ep管中；

(5)向步骤(4)的ep管中加入2.5倍体积的无水乙醇，其中蛋白酶k组需要先加1/10体积的naac（3mol/l，ph5.2），-20℃放置20min，离心收集基因组dna；

(6)向步骤(5)的ep管中加入1ml的70％乙醇洗涤dna，去上清，敞口晾干基因组；

(7)向步骤(6)的ep管中加入100µlte缓冲液，溶解基因组dna沉淀。利用光密度测定法测定基因组dna的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。

实施例3：

本实施例用于说明利用溴酸钠法（nabro3法）和蛋白酶k短时间消化法分别提取唾液中口腔粘膜上皮细胞dna的操作。

(1)样品预处理：将唾液2000g离心10min，弃上清，用1ml的生理盐水悬浮口腔粘膜上皮细胞，再2000g离心10min，弃上清。

(2)往eppendorf（ep）管中加入400μl的细胞裂解液,充分混匀至无明显的细胞团。其中细胞裂解液配方为：10mmol/ltris-hcl(ph8.0)，30mmol/ledta(ph8.0)，0.5%sds，rnasea(20μg/ml)。

(3)分别采用蛋白酶k短时间消化法和溴酸钠法来提取基因组dna。蛋白酶k法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶k，充分混匀，56℃消化5min。溴酸钠法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为1mol/l的离液剂溴酸钠，充分混匀。其余步骤相同。

(4)向步骤(3)的ep管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的ep管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将上清转移至另一洁净的ep管中；

(5)向步骤(4)的ep管中加入2.5倍体积的无水乙醇，其中蛋白酶k组需要先加1/10体积的naac（3mol/l，ph5.2），-20℃放置20min，离心收集基因组dna；

(6)向步骤(5)的ep管中加入1ml的70％乙醇洗涤dna，去上清，敞口晾干基因组；

(7)向步骤(6)的ep管中加入100µlte缓冲液，溶解基因组dna沉淀。利用光密度测定法测定基因组dna的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。

实施例4：

本实施例用于说明利用不同浓度的溴酸钠（nabro3）和1mol/l的高氯酸钠分别提取人血液白细胞dna的操作。

(1)样品预处理（可选）：往200μl的抗凝血中加入400μl的红细胞裂解液，混匀后2000g离心10min，弃上清。若仍有较多的红细胞残留，也可重复裂解一次。

(2)往eppendorf（ep）管中加入400μl的上述细胞裂解液,充分混匀至无明显的细胞团。

(3)分别采用高氯酸钠法和溴酸钠法来提取基因组dna。高氯酸钠法：向步骤（2）ep管中加入终浓度为1mol/l的高氯酸钠，充分混匀。溴酸钠法：向步骤（2）ep管中加入终浓度分别为0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l、1mol/l和3mol/l的溴酸钠，充分混匀。其余步骤相同。

(4)向步骤(3)的ep管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的ep管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将上清转移至另一洁净的ep管中；

(5)向步骤(4)的ep管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放置20min，离心收集基因组dna；

(6)向步骤(5)的ep管中加入1ml的70％乙醇洗涤dna，去上清，敞口晾干基因组；

(7)向步骤(6)的ep管中加入100µlte缓冲液，溶解基因组dna沉淀。利用光密度测定法测定基因组dna的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的完整性。

测试实施例

将实施例1-4提取的人基因组dna的纯度和浓度进行汇总，结果如表1所示。

表1.利用不同方法对不同来源的样本提取基因组dna的参数比较。

根据表1的数据可见，在蛋白酶k消化时间充分（实施例中采用了40min的消化时间）的情况下，相同来源的口腔粘膜上皮细胞，溴酸钠法和蛋白酶k法的dna得率及纯度相当；然而，当消化时间大幅缩短（实施例中采用了5min的消化时间）导致蛋白酶k无法充分消化组蛋白的情况下，蛋白酶k法的dna得率大幅降低，而本发明所涉及的离液剂溴酸钠能快速分离组蛋白和基因组dna，这种方法所提dna的得率约为蛋白酶k法的5倍，而dna纯度未受影响。0.1-3mol/l的溴酸钠均能提取基因组dna，1-3mol/l的溴酸钠所提取的浓度最高且相对稳定。1mol/l的溴酸钠和1mol/l的高氯酸钠所提取的基因组dna在得率和纯度上相当。

将实施例1-4提取的人基因组dna进行电泳检测，结果如图1-图3所示。其中：

图1是溴酸钠法（nabro3法）和蛋白酶k法（消化40min）分别提取唾液法和口腔拭子法采集口腔粘膜上皮细胞dna的电泳检测结果。m为dnamarker（分子量自上而下分别为：2000、1000、750、500、250、100，单位为bp），泳道1为蛋白酶k法提取的唾液来源口腔粘膜上皮细胞dna，泳道2为溴酸钠法提取的唾液来源口腔粘膜上皮细胞dna，泳道3为蛋白酶k法提取的口腔拭子来源口腔粘膜上皮细胞dna，泳道4为溴酸钠法提取的口腔拭子来源口腔粘膜上皮细胞dna。根据图1可见，在蛋白酶k消化时间充分的情况下，相同来源的口腔粘膜上皮细胞，溴酸钠法和蛋白酶k法的dna得率及纯度相当。

图2是溴酸钠法（nabro3法）和蛋白酶k法（仅消化5min）分别提取唾液法采集口腔粘膜上皮细胞dna的电泳检测结果。m为dnamarker（分子量自上而下分别为：2000、1000、750、500、250、100，单位为bp），泳道1为蛋白酶k法提取的唾液来源口腔粘膜上皮细胞dna，泳道2为溴酸钠法提取的唾液来源口腔粘膜上皮细胞dna。根据图2可见，在消化时间短的情况下，本发明所用的溴酸钠法要比传统的蛋白酶k法有更高的dna得率。

图3是不同浓度的溴酸钠（nabro3）和1mol/l的高氯酸钠分别提取人血液白细胞dna的电泳检测结果。m为dnamarker（分子量自上而下分别为：2000、1000、750、500、250、100，单位为bp），泳道1-5分别为终浓度0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l、1mol/l和3mol/l的nabro3提取的人血液白细胞基因组dna，泳道6为终浓度为1mol/l的高氯酸钠提取的人血液白细胞基因组dna。根据图3可见，0.1mol/l-3mol/l的nabro3均能提取细胞基因组dna，其中1mol/l-3mol/l的nabro3提取的基因组差别不大。1mol/l-3mol/l的nabro3与1mol/l的高氯酸钠法的得率相当。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。