本发明属于细胞免疫领域，涉及cik细胞，具体涉及改性壳聚糖在cik细胞培养方面的应用及制备商品化培养基、培养器皿的用途。
背景技术：
：壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d葡萄糖。自1859年，法国人rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。针对患者，壳聚糖降血脂、降血糖的作用已有研究报告。生物治疗是继手术、化疗及放疗3种传统模式之后的第4大肿瘤治疗模式，前3种模式或毒副作用较大，或不能清除体内残存肿瘤细胞，大部分肿瘤患者终因复发或难治而导致死亡。细胞免疫治疗技术在肿瘤的生物治疗中占有重要地位,显示出良好的应用前景，并逐渐成为肿瘤治疗的重要手段之一。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，cik)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。cik细胞的主要效应细胞为cd3+cd56+表型t淋巴细胞，兼有nk细胞和t细胞的特征。在功能上，cik一方面拥有t淋巴细胞强大抗肿瘤活性，另一方面拥有nk细胞非mhc限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。cik细胞的扩增活力和杀瘤活性直接关系到治疗成本和效果。目前尚未见壳聚糖及其衍生产品在cik细胞培养扩增方面的应用。技术实现要素：本发明旨在提供一种改性壳聚糖，以及该改性壳聚糖在cik细胞培养方面的应用及制备商品化培养基、培养器皿的用途，该改性壳聚糖可以提高cik细胞的扩增活力和杀瘤活性，降低细胞治疗成本并提升治疗效果。本发明通过如下技术方案得以实现：一种离子液体辐照改性壳聚糖，由如下方法制备而成：用离子液体对壳聚糖辐照改性，所述离子液体的阳离子的化学结构式如下：其中，r为己基或辛基。优选地，所述离子液体的阴离子为溴离子或氯离子，离子液体的化学结构式如下：优选地，所述改性壳聚糖由如下方法制备而成：先将离子液体用水溶解制成8-12mmol/l的离子液体水溶液，然后向该离子液体水溶液中添加壳聚糖，至完全溶解混合均匀，壳聚糖浓度为30-50g/l，再将该溶液于搅拌条件下辐照反应，辐照剂量为40-60kgy，最后用乙醇沉淀洗涤、抽滤，收集滤饼，滤饼干燥研磨即得。上述改性壳聚糖在cik细胞培养方面的应用。一种用于cik细胞培养的培养基，含有有效浓度的上述改性壳聚糖。一种用于cik细胞培养的培养器皿，培养器皿内壁包被有有效厚度的包被层，包被层的材料为上述改性壳聚糖。优选地，该培养器皿内部用氩气填充密封。本发明优点：本发明提供了一种改性壳聚糖，实验证明该改性壳聚糖可以提高cik细胞的扩增活力和杀瘤活性，可以用于降低细胞治疗成本并提升治疗效果，用于制备商品化培养基、培养器皿。附图说明图1为各离子液体的化学结构式。具体实施方式为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：改性壳聚糖的制备根据采用的离子液体种类不同，实验分为4组平行操作，即己基溴化吡啶组、己基氯化吡啶组、辛基溴化吡啶组、辛基氯化吡啶组。改性方法如下：先将上述离子液体用水溶解制成10mmol/l的离子液体水溶液，然后向该离子液体水溶液中添加壳聚糖，至完全溶解混合均匀，壳聚糖浓度为40g/l，再将该溶液于搅拌条件下辐照反应(辐照源为co60)，辐照剂量为50kgy，最后向溶液中加入95％乙醇(6倍于反应溶液体积)静置沉淀，抽滤洗涤收集滤饼，滤饼于40℃以下低温干燥后研磨至80目。当然，离子液体水溶的浓度可以在8-12mmol/l调整，壳聚糖浓度可以在30-50g/l，辐照剂量可以在40-60kgy调整。干燥温度不要超过40℃，否则会变色。各离子液体化学结构式如图1所示。实施例2：改性壳聚糖对cik细胞扩增活力和杀瘤活性的影响一、实验材料10％胎牛血清和rpmi-1640培养液购于gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司(tbd)，il-2购自北京双鹭药业股份有限公司，抗人cd3单抗购自gibco公司，ifn-γ购自美国peprotec公司，il-1α购自美国peprotec公司，cck-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。balb/c裸鼠，均选用雌性裸鼠，鼠龄6-7周，体重18-23g，在spf条件下的裸鼠室内饲养，由南京大学实验动物中心提供。胃癌mgc-803细胞购自上海歌凡生物细胞库。二、实验方法1、cik细胞的分离和培养(1)单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血，预冷的pbs1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，rpmi-1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％co2孵箱中孵育2h。(2)cik细胞的培养：收集单核细胞中的悬浮细胞，调整细胞密度至2.5×106/ml，均分为三组进行培养，分组及培养方法如下：常规组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，添加il-2(500u/ml)、il-1α(l00u/ml)和抗人cd3单抗(20μg/ml)。每2-3d进行换液，并补充等量的细胞因子，在培养过程中，添加新鲜培养基前用台盼蓝染色检测细胞的活率，统计细胞的绝对数目；连续培养12天，收集细胞；对比组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和未改性壳聚糖(30μg/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞；诱导a-d组：0天时，在完全培养基(rpmi-1640+10％fbs)中加入inf-γ(1000u/ml)和上述己基溴化吡啶组、己基氯化吡啶组、辛基溴化吡啶组、辛基氯化吡啶组制备的改性壳聚糖(30μg/ml)，放入5％co2、37℃培养箱中孵育24h后，按照常规组后续方法培养，统计细胞的绝对数目，收集细胞。2、cik细胞的体外肿瘤杀伤活性使用cck-8法检测体外各组cik细胞对胃癌mgc-803细胞的杀瘤活性，以对数生长期的mgc-803细胞作为靶细胞，待贴壁培养24h后，分别以培养12天的各组cik细胞作为效应细胞，分别置于37℃、5％co2、饱和湿度下的细胞培养箱中，待贴壁24h后，按效靶比为10:1加入效应细胞，设效应细胞对照与靶细胞对照，每组3个复孔，效应细胞与靶细胞共培养24h后，每孔按10％的体积加入cck-8溶液，置于培养箱中继续孵育培养4h后，酶联免疫捡测仪选择波长为450nm测定各孔光吸光值，并按照下式计算杀伤活性(杀伤率)：杀伤率＝[1-(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值]×l00％。3、cik细胞的体内肿瘤杀伤活性将balb/c裸鼠右腋皮下接种0.2ml1×106/mlmgc-803胃癌细胞后，再随机分成7组：对照组、常规组、对比组和诱导a-d组，每组20只。10d后常规组、对比组和诱导a-d组的每只裸鼠在接种肿瘤细胞部位处注射0.2ml1×107/ml的cik细胞(分别对应按照上述常规组、对比组、诱导a-d组诱导培养12天)，对照组裸鼠注射0.2ml生理盐水，连续注射5d。15d后每组剥离肿瘤块并称重，按照如下公式计算抑瘤率(％)：抑瘤率＝(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100％。4、统计学分析使用spss20.0统计学软件进行t检验，p<0.05认为差异显著。三、实验结果1、各组cik细胞的增殖与活率接种时各组都为2.5×106个细胞，培养至第12天时，各组增殖倍数如下表所示，与常规组相比，对比组无显著性差异(p＞0.05)，诱导a-d组增殖倍数显著提高，与常规组相比具有显著性差异(p＜0.05)。每次补液前台盼蓝染色检测细胞活率，保证活率约95％。常规组对比组诱导a组诱导b组诱导c组诱导d组增殖倍数1771852762793083022、体外各组cik细胞对胃癌mgc-803细胞的杀瘤活性分别取培养至第12天时各组cik细胞对mgc-803细胞进行杀伤实验，在效靶比为10:1时，各组cik细胞均表现出明显的杀瘤活性，其中诱导组制备的cik细胞比常规组和对比组制备的cik细胞具有更强的杀瘤活性，且差异显著(p＜0.05)。各组cik细胞对mgc-803细胞的杀伤率如下表所示。3、体内各组cik细胞对胃癌移植瘤的杀瘤活性全部实验裸鼠在接种第7天时在接种部位均有肿瘤形成，直径为0.8-1cm。cik细胞干预15天后，常规组、对比组、诱导组所有裸鼠的肿块均有所缩小，而对照组所有裸鼠的肿块均增大。解剖时发现，与对照组相比，常规组、对比组、诱导组的肿瘤块较小且局限，而对照组的肿瘤块大且有肿瘤局部浸润现象。常规组、对比组、诱导组抑瘤率见下表。从上表可以看出，诱导组比常规组和对比组具有更优的体内抑瘤率，差异显著(p＜0.05)。实施例3：改性壳聚糖的应用(制备商品化培养基和包被培养瓶)培养基：在现有的rpmi-1640培养液中添加实施例1制备的改性壳聚糖，质量体积浓度为30μg/ml，当然也可以设计成其他的浓度。包被细胞培养瓶：在现有的细胞培养瓶(或其他可能用于cik细胞培养的容器，如培养皿)内表面包被0.2-0.3mm厚度的包被层，包被层材料即为上述改性壳聚糖。在一个优选实施例中，将包被有该包被层的细胞培养瓶中填充满氩气密封储存。若不填充满氩气，50±5℃放置30天，包被层颜色显著加深，由乳白色变成深褐色(cik细胞培养效果显著降低)；若用氩气保护则不会出现这种情况。该方法可以提高包被培养瓶的高温稳定性，延长保质期。上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。当前第1页12