一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一株可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株，和其粗提产物的杀虫效果。

背景技术：

在与环境相互作用过程中，丝状真菌形成了独特的应对环境胁迫机制。其中，合成真菌毒素抵御敌害生物的吞食是其重要的生存策略之一。大多数丝状真菌在昆虫吞食时合成诱导性毒素。有些丝状真菌如烟曲霉(aspergillusfumigatus)、黄曲霉(aspergillusflavus)等在正常生理条件下合成组成性毒素。粗糙脉孢菌基因组中含有6个聚酮类合成酶基因(polyketidesynthasegene,pks)。前期研究发现pks-6基因的敲除菌株极易遭致跳虫的吞食。利用乙酸乙酯分别提取pks-6基因的敲除菌株和pks-6基因高表达菌株的代谢产物，并给大蜡螟注射相同剂量的后发现：在培养的第12天，pks-6基因的敲除菌株代谢产物导致的大蜡螟的死亡率为68％，pks-6基因高表达菌株的代谢产物导致大蜡螟的死亡率为100％，由上可见pks-6基因的产物呋喃香豆素(neurosporina)具有杀虫效果。但是，呋喃香豆素在野生型粗糙脉孢菌中的积累水平较低，模式真菌构巢曲霉生长速度较快，遗传背景清晰，且次级代谢产物积累量较多。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明是利用同源重组的原理，将粗糙脉孢菌pks-6基因在遗传改造后的构巢曲霉中进行异源表达，获得了一株高产呋喃香豆素的重组菌株，并且该菌株的乙酸乙酯粗提取产物具有较强的杀虫效果。

本发明的第一个目的在于提供一种可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株；

本发明的第二个目的在于提供利用上述重组菌的构建方法；

本发明的第三个目的在于提供一种该菌株的乙酸乙酯粗提物用于杀虫的用途。

为了实现上述目的，本发明首先提供一种pks-6重组表达质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks6，其特征在于，所述重组表达质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6的碱基序列如seqidno.1所示。

另一方面，本发明提供一种包含重组表达质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6的重组菌株。

另一方面，本发明提供一种重组表达质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6转化的宿主细胞。

另一方面，重组表达质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6转化的宿主细胞是构巢曲霉l08030。

另一方面，本发明提供一种重组载体pyh-wa-pyrg-ki-pks-6的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组dna为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pyh-wa-pyrg-ki连接。

另一方面，本发明提供一种pks-6构巢曲霉重组菌株的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组dna为模板，扩增pks6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pyh-wa-pyrg-ki连接；利用原生质体转化的方法将pyh-wa-pyrg-ki-pks6转入构巢曲霉l08030中，利用不含pyrg的培养基筛选重组菌株，并利用pcr进行验证。

另一方面，本发明提供一种含有pks-6基因重组构巢曲霉l08030的粗提产物的杀虫剂。所述的提取溶剂为乙酸乙酯。

另一方面，本发明提供一种杀虫剂用于杀灭昆虫的应用，所述昆虫为大蜡螟、果蝇。

发明详述：

(1)重组菌株的构建

以粗糙脉孢菌基因组dna为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pyh-wa-pyrg-ki连接。利用原生质体转化的方法将pyh-wa-pyrg-ki-pks-6转入构巢曲霉l08030中，利用不含pyrg的培养基筛选重组菌株，并利用pcr进行验证。

(2)重组菌株的大量培养

将大米和自来水的比例以1：1混合均匀后，放入灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌。待冷却后，加入重组菌株的液体培养物，并利用无菌的玻璃棒搅拌均匀，置于温度为30℃，相对湿度为50％的培养箱中进行培养14天。

(3)对果蝇毒性的影响

利用乙酸乙酯分别提取构巢曲霉l08030和pks-6基因重组菌株代谢产物，利用旋转蒸发仪挥干溶剂后，加入dmso溶解代谢产物。将上述溶液加入熔化后且温度降至45℃的果蝇培养基中。待培养基凝固冷却后，每组接种50条果蝇幼虫，以仅加入dmso的培养基作为对照组。观察并记录果蝇的生长发育情况。

(4)对大蜡螟毒性的影响

利用乙酸乙酯分别提取构巢曲霉l08030和pks-6基因重组菌株代谢产物，利用旋转蒸发仪挥干溶剂后，加入dmso溶解代谢产物，利用生理盐水将dmso的浓度稀释至2％，将按每支蜡螟0.1毫克粗提物的剂量进行注射，以2％dmso生理盐水溶液作为对照组。每组50条大蜡螟。观察并计算大蜡螟的存活率。

本发明中的pks6基因与pks-6基因是同一种基因。

有益效果

本发明中pks6重组质粒转化构巢曲霉能大量积累呋喃香豆素，pks6重组质粒转化构巢曲霉培养方法简单，成本低廉，且该菌株的乙酸乙酯粗提物可有效杀死大蜡螟并抑制果蝇的生长发育，可有效用于昆虫的防治。

附图说明

图1:pyh-wa-pyrg-ki载体及酶切电泳图(m：1kbdnaladder；1:pyh-wa-pyrg-ki质粒；2:nhei酶切后的pyh-wa-pyrg-ki)

图2：pks-6基因pcr扩增后的电泳图谱(m：1kbdnaladder；1:pks-6)

图3：重组质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6(m：1kbdnaladder；1:pyh-wa-pyrg-ki质粒；2，3:重组质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6)

图4:培养7天时，pks-6基因重组构巢曲霉l08030代谢产物(实验组)对果蝇羽化率和死亡率的影响。

图5：pks-6基因重组构巢曲霉l08030代谢产物(实验组)对大蜡螟存活率的影响。

具体实施方式

实施例1：

1.重组载体的构建

1.1载体的准备

pyh-wa-pyrg-ki全长7162bp,包含swai、nhei、noti等多个常用酶切位点。此载体上wa序列与构巢曲霉中wa基因序列相同，且载体上含有营养筛选标记基因pyrg，载体上还带有amp抗性基因，在构建质粒时起筛选作用。利用试剂盒(高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪公司)提取质粒后，nhei单酶切质粒，并回收(图1、图2、图3)。

1.2dna片段的扩增

在超净工作台中挑取野生型粗糙脉孢菌菌丝到试管斜面培养基中，30℃黑暗条件培养7d后转接到含有30ml液体培养基三角瓶中，150rpm，30℃摇床培养4d。收集菌丝体，利用试剂盒方法提取基因组dna。根据粗糙脉孢菌基因组dna序列，通过primerblast软件设计引物，获得引物序列：pks6-f：tccttctcctgatcgctagcatggcccctcacagcactc(seqidno.2)；pks6-r：acagaataactctcgctagctcaagcatcctgagcctccatc(seqidno.3)，片段大小为长度为7293bp。

1.3构建pyh-wa-pyrg-ki-pks-6重组质粒的构建

本实验利用无缝克隆试剂盒(novorecpcr一步定向克隆试剂盒，neb(北京)有限公司)构建重组载体。以氨苄霉素为筛选标记，利用pcr技术对重组载体进行验证。检验引物为：

tpks6-f：actagccacactcgtgacag(seqidno.4)；和tpks6-r：

ctcgaagtcaattgcagccg(seqidno.5)，长度为1475。

2.构巢曲霉原生质体制备

2.1构巢曲霉原生质体制备

从-80℃冰箱中取出构巢曲霉菌株，放在冰上融化。待融化后，用牙签蘸取少量孢子悬液在含有gmm培养基的平板上划线，在37℃培养箱中培养7天。向三角瓶中倒入30ml液体培养基，用牙签在平板上刮取适量的孢子于液体培养基中，摇匀成孢子悬液。放在37℃,200rpm摇床中摇6-8h。吸取少许悬液制片，在光学显微镜下镜检。当萌发的孢子芽的长度为孢体直径两倍时即可。将孢子液倒入50ml离心管中，离心机离心，沉淀菌体。离心机离心条件：12000rpm,4℃,离心5min。缓慢倒掉上清液，在离心管中加入4-5ml的stcbuffer,用移液枪吹匀离心，条件同上。用移液枪轻轻吸掉上清液，向离心管中加入3-5ml的酶液(om+enzyme),移液枪轻轻吹打混匀。在200rpm,37℃摇床中摇14-16小时。吸取少量制片，在光学显微镜下观察。当观察到大部分出芽的孢子细胞壁酶解，孢子成圆形透明戒指状时即表示细胞壁酶解成功。将酶解好的原生质体分装到1.5ml离心管中，每管750μl。向离心管中加入750μl的trappingbuffer,注意加入trappingbuffer时应该沿着离心管壁缓慢加入，切忌上下颠倒混匀。5000rpm，4℃离心15min。将离心管中悬浮的白色絮状物转移到新离心管中，加入500μlstcbuffer，吹打混匀，6000rpm，4℃离心6min。弃上清，加入300μlstcbuffer，重悬原生质体，4℃冰箱保存待用。

2.2pks6重组质粒转化构巢曲霉

(1)将smm上层培养基在微波炉融化，于50℃水浴锅中保温待用。

(2)20μlpyh-wa-pyrg-ki-pks-6与100μl原生质体混合，冰浴50min。

(3)加入1.25ml的pegsolution,将离心管横放手中，轻轻搓动10-15次，室温下静置20min。

(4)加入6mlstcbuffer,上下颠倒混匀。

(5)取50ml离心管，倒入10ml上层培养基，慢慢冷却至40℃左右。将原生质体混合液倒入培养基中，轻轻上下颠倒混匀，倒入提前准备好的下层平板培养基中，37℃培养箱培养2天。

2.3转化子pcr检测

将转化平板上的白色单菌落挑到缺陷培养基上连续传代后，提取其基因组dna，通过pcr检测pyrg基因是否存在于转化子的基因组dna中。根据已知的pyrg序列，通过primerblast软件设计扩增pyrg片段，引物为：pyrg-f：gtacctgactacagagtagt(seqidno.6)，pyrg-r：cagcttccgtacggtcagcg(seqidno.7)。

3.对昆虫的毒性作用

3.1对果蝇的影响

果蝇属于双翅目短角亚目昆虫，是一种常用的实验室动物模型。将果蝇随机分成3组，每组60只。分别为：空白对照组、构巢曲霉l08030组，实验组(pks-6基因重组构巢曲霉l08030代谢产物)。分组后的果蝇在26℃条件下饲养。饲喂后，于各指管中随机取300条蝇蛆，放入相应的含有不同物质的饲料中。进行观察。由图4可知，实验组可以抑制果蝇的羽化，并且可以导致果蝇的死亡。

3.2对大蜡螟的影响

大蜡螟属于鳞翅目、螟蛾科、蜡螟亚科、蜡螟属的昆虫，是世界范围内蜂群中普遍存在的一种害虫，由于其幼虫生长周期短易于繁殖，被用于模式昆虫。将大蜡螟随机分成3组，每组80只。分别为：空白对照组、构巢曲霉l08030组，实验组(pks-6基因重组构巢曲霉l08030代谢产物)。对其进行血腔药物注射。观察其死亡率。给大蜡螟注射不同的物质后将其置于室温条件下进行培养，在培养的第一天，实验组的存活率为80％，随着时间的进行，大蜡螟的死亡率急剧升高，在注射后的第五天，实验组的大蜡螟全部死亡，毒性明显高于粗糙脉孢菌中pks6高表达菌株。而对照组在培养的第六天存活率为96％，构巢曲霉l08030组中大蜡螟的存活率较对照组略有下降(图5)。

<110>江苏师范大学

<120>一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>14455

<212>dna

<213>人工序列

<223>重组质粒pyh-wa-pyrg-ki-pks-6

<400>1

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