一种杀蚊子幼虫的苏云金芽胞杆菌及其应用的制作方法
本发明属卫生害虫的生物防治技术领域。本发明涉及一种对蚊子幼虫具有高效杀虫活性的苏云金芽胞杆菌菌株，涉及对该菌株基因组学的分析方法，涉及一种杀蚊子幼虫的苏云金芽胞杆菌的制备方法及在蚊子生物防治领域的应用。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis,bt)于1901年在日本被发现，1911年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名。其是一种革兰式阳性细菌，广泛分布于各种生境，是迄今为止使用最安全、最广泛的一种杀虫细菌。其发挥杀虫作用的是形成于稳定生长期的伴孢晶体(parasporalcrystalprotein)，又称为杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein,icp)，已报道icps对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等各种昆虫，线虫，原生动物和癌细胞有生物活性(schnepfe.,crickmoren.,riej.v.,etal.,bacillusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins,microbiolmolbiolrev.,1998,62(3):775-806)。由于bt杀虫的特异性、高效性以及对环境安全和人畜无害，已经广泛用于病原媒介昆虫的生物防治以及转基因抗虫作物的培育，并产生了良好的经济、环境和社会效益。
在世界范围内，蚊子作为病原媒介载体在人和动物之间传播致病病毒和寄生虫，例如疟疾、黄热病、登革热、丝虫病、圣路易斯脑炎和西尼罗河病毒(tollem.a.,mosquito-bornediseases.curr.probl.pediatr.adolesc,healthcare,2009,39,pp.97-140)。据世界卫生组织(who)估计，全世界约有一半的人口正面临着疟疾的风险，已发现的2.5亿例疟疾报告已经导致约100万人的死亡，这其中有91％发生在非洲，85％是发生在5岁以下的儿童身上。近年来，登革热和黄热病也成为了重大的国际公共卫生问题，每年有数千万例的感染报告，造成数十万人的死亡。
目前，针对西尼罗河病毒、登革热、疟疾和丝虫病的预防药物和疫苗，或者太昂贵，或者由于其高危险性而不能对人类使用。为了降低这些疾病的发病率，人们致力于控制蚊子的种群数量，其中喷洒化学杀虫剂如马拉硫酸和滴滴涕(ddt)，在短期内取得了非常好的效果。但是这些化学杀虫剂的残留物对于蚊子之外的生物，包括人类和家畜都产生了极其负面的影响，而且对自然环境中的生物链和土壤也产生了极大的破坏。而杀蚊生物农药，特别是苏云金芽孢杆菌，由于其高效的杀蚊活性，以及对其他生物和环境的安全性，而备受关注(bravoa.,etal.,modeofactionofbacillusthuringiensiscryandcyttoxinsandtheirpotentialforinsectcontrol,toxicon,2007,49(4):423-435)。
苏云金芽孢杆菌以色列亚种(b.thuringiensissubsp.israelensis,bti)自1976年被发现以来，其对蚊子和黑蝇幼虫的特异性和高毒性已经被广泛研究，发现bti主要包含有四种杀虫晶体蛋白cry4aa、cry4ba、cry11aa和cyt1aa(claudiastein,garethw.jones,tanyachalmers,colinberry.transcriptionalanalysisofthetoxin-codingplasmidpbtoxisfrombacillusthuringiensissubsp.israelensis,applied&environmentalmicrobiology,2006,72(3):1771-1776)。此后，科学家相继发现了多个bt亚种具有杀蚊活性，如canadensisi亚种、morrisoni亚种、jegathesan亚种、thompsoni亚种、kyushuensis亚种、medellin亚种和darmstadiensis亚种等。同时，也有多种杀蚊晶体蛋白被陆续报道发现，如cry4a、cry4b、cry11a、cry19a、cry19b、cry30、cry40、cyt以及binarytoxin等。bti作为最早被发现的杀蚊菌株，已经被作为商业化的生物杀蚊剂广泛应用于对蚊子种群的控制。野生bt菌株s2160-1从广西大王岭原始森林的土壤中分离得到，其对白纹伊蚊幼虫的杀虫活性明显高于bti，而且菌株所含有的杀虫基因种类和数量均不同于bti，因此s2160-1对于研究、开发新的高效bt生物杀蚊制剂具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对蚊子幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌新菌株bts2160-1，该菌株是一种革兰氏阳性菌，是一种生物杀蚊制剂候选菌株，也可以应用于构建杀蚊工程菌。
本发明的菌株是一株野生型菌株，是从广西大王岭原始森林的土壤中分离得到的一种苏云金芽胞杆菌新菌株，该菌株已于2016年11月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc,北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所,邮编100101)()，分类命名为苏云金芽孢杆菌s2160-1(bacillusthuringiensiss2160-1,bts2160-1)，保藏编号为cgmccno.13274。
本发明菌株bts2160-1通过醋酸钠+抗生素+温度方法筛选得到。将收集的土壤样品在室温下进行风干预处理，研碎混匀，然后称取1g土壤样品至10ml的bpa培养液中，再加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素至400μg/ml，然后30℃，220rpm摇床培养4h。静置30min，取10ml土壤悬浮液，置于75℃水浴处理20min，每隔几分钟振荡一次。取1ml上清液，进行10倍梯度稀释操作，共设置4个稀释梯度(10-1,10-2,10-3,10-4)，各浓度分别取200μl涂布到na琼脂培养平板，每个浓度3个重复处理，将平板倒置培养于30℃培养箱。3天后，根据菌苔颜色、厚度、表面光泽度和边缘是否整齐等形态，挑取不同的单菌落进行石碳酸复红染色，在油镜下观察菌体形态、晶体的形状、大小和数量(见图1)。发现一株含有球形晶体形态的bt菌株，遂命名为bts2160-1。
本发明菌株bts2160-1的伴孢晶体蛋白利用扫描电镜鉴定。g-tris培养基中30℃培养72h，提取芽孢和伴孢晶体混合物，取10μl混合物样品涂在盖玻片上，经过2.5％的戊二醛4℃过避光、过夜固定，然后用不同浓度乙醇逐级脱水、干燥，1％的四氧化锇(oso4)固定，真空镀膜喷金，扫描电子显微镜下观察晶体的形状。该菌株晶体蛋白形状为球形，与杆状营养细胞相连或者单独散落存在(见图2)。
本发明菌株bts2160-1的大质粒dna脉冲场电泳分析显示，菌株所含的大质粒数量较少，主要含有一个大于350kb的大质粒(见图3)。菌株bts2160-1的伴孢晶体蛋白利用sds-page电泳标明，在其芽孢后期主要产生140kda、130kda、80kda、50kda和30kda左右大小的蛋白(见图4)，所产生的杀蚊蛋白目前鉴定出来主要有cry4cb3、cry50ba和cry54ba2等。相较之下，菌株bti在其芽孢后期所产生的的蛋白大小主要为130kda、80kda、50kda和30kda，所包含的杀蚊蛋白主要有cry4aa，cry4ba，cry11aa和cyt1aa。bti所含有的杀蚊蛋白基因与菌株bts2160-1相较，存在很大的种类和数量差别。
本发明菌株bts2160-1的基因组测序利用illuminahiseq2000平台完成，测序后原始数据经过过滤和质控、soapdenovo短序列组装共获得82个scaffold(contig)。以ncbi上公布的26个完成基因组测序的bt菌株基因组作为参考序列，拼装获得菌株bts2160-1的染色体基因组和质粒基因组，利用cgviewserver完成基因组可视化草图的绘制(见图5和图6)。
本发明菌株bts2160-1的蛋白以小菜蛾作为靶标昆虫，采用浸叶法进行生物活性测定，每次测定设置3个重复，每个重复10头小菜蛾3龄幼虫，观察72h，结果发现bts2160-1的伴孢晶体蛋白对小菜蛾没有生物活性。以致倦库蚊作为靶标昆虫，每次测定设置3个重复，每个重复30头致倦库蚊3龄幼虫，观察48h，统计结果显示对致倦库蚊3龄幼虫的lc50为5.668ng/ml。以白纹伊蚊作为靶标昆虫，每次测定设置3个重复，每个重复30头白纹伊蚊3龄幼虫，观察48h，统计结果显示对白纹伊蚊3龄幼虫的lc50为21.113ng/ml。
本发明菌株bts2160-1对致倦库蚊3龄幼虫的活性低于who推荐的控蚊bt菌株bti的活性(1.718ng/ml)，但是对白纹伊蚊3龄幼虫的活性是bti菌株(45.585ng/ml)的2.2倍，优势明显，可以作为bti之外控蚊微生物菌剂的有力补充，甚至能够作为bti的替代物来控制白纹伊蚊的种群，有利于降低由于长期使用bti晶体蛋白控制蚊子种群而导致抗性产生的风险。
附图说明：
图1：菌株bts2160-1石碳酸复红染色光学显微镜观察(100╳油镜)
图2：菌株bts2160-1伴孢晶体蛋白扫描电镜观察
图3：菌株bts2160-1大质粒dna脉冲场电泳分析
图4：菌株bts2160-1伴孢晶体蛋白sds-page分析
注：1：芽孢形成前期bti菌株的蛋白；2：芽孢形成后期bti菌株的蛋白；3：bti菌株的晶体蛋白经过1ug/ml胰蛋白酶处理；4：芽孢形成前期bts2160-1菌株的蛋白；2：芽孢形成后期bts2160-1菌株的蛋白；3：bts2160-1菌株的晶体蛋白经过1ug/ml胰蛋白酶处理
图5：菌株bts2160-1基因组测序及信息学分析流程
图6：菌株bts2160-1基因组草图
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例内容，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。
实施例1
土壤样品的采集与bt菌株的分离培养
土壤采样时间选择夏秋季节(5月～10月)，选择广西大王岭自然保护区向阳坡，为了增加获取新菌株的概率，采样点尽量选择植被保护完整、生态环境没有人为干预少、土壤腐殖质丰富的地方最佳。bt菌株筛选采取醋酸钠+抗生素+温度筛选法，称取1g土壤样品至10ml的bpa培养液中，再加入青霉素钠盐和硫酸庆大霉素至400μg/ml，然后30℃，220rpm摇床培养4h。静置30min，取10ml土壤悬浮液，置于75℃水浴处理20min，每隔几分钟振荡一次。取1ml上清液，进行10倍梯度稀释操作，共设置4个稀释梯度(10-1,10-2,10-3,10-4)，各浓度分别取200μl涂布到na琼脂培养平板，每个浓度3个重复处理，将平板倒置培养于30℃培养箱。3天后，根据菌苔颜色、厚度、表面光泽度和边缘是否整齐等形态，挑取不同的单菌落进行石碳酸复红染色，在油镜下观察菌体形态、晶体的形状、大小和数量。若观察到分离株具有无色芽孢，则认定为芽孢杆菌；若还产生有伴孢晶体，则认定为bt菌株。
实施例2
扫描电镜观察bts2160-1菌株晶体蛋白
bt菌株在g-tris培养基中30℃培养至芽孢完全形成，4℃，12,000g离心10min收集500μl菌体，然后用1m冰冷的nacl洗涤菌体3次，最后菌体悬浮于500μl冰冷超纯水中。取10μl芽孢和伴孢晶体混合物小心平铺在洁净的盖玻片上，然后4℃低温真空干燥，然后用1％四氧化锇(oso4)进行样品固定，样品被置于金属样品台上，放入真空蒸发器中喷镀一层约20nm厚的金属膜。准备好的样品置于s3-400n扫描电镜(hitachiltd,japan)，20kv电压条件下进行图像观察记录。
实施例3
sds-page电泳分析bts2160-1菌株晶体蛋白
bt菌株在200ml的g-tris培养基中培养3天以上，培养条件为30℃，220rpm振荡培养。光学显微镜观察，确认芽孢充分形成，4℃，12,000g离心10min收集伴孢晶体和芽孢混合物。沉淀用等体积冰冷的1m的nacl洗涤3次，然后超声波破碎细胞处理20min(modelvc-130,sonicsandmaterialsinc,usa)。4℃，12,000g离心10min，收集沉淀，溶于5ml的50mm的na2co3溶液(ph＝10.0)中。一般7.5％或者12％的sds-page可用于分析bt菌晶体蛋白组成，5ul制备好的伴孢晶体蛋白与5ul的2×sds-pagesamplebuffer[0.075mtris·cl,(ph6.8)；0.020medta；2％sds；0.02％bromophenolblue；0.25mdithiothreitol(dtt)；50％glycerol]混合，100℃沸水中煮5min，然后12,000g离心5min，上清立即上样，在100v电压下，利用mini-proteinii,cellslabverticalapparatus装置(biorad,usa)()电泳大约1h，然后用coomassiebluer250进行染色，蛋白质大小根据标准蛋白质量标准进行判断。
实施例4
bt菌株质粒dna提取纯化
在lb培养基，30℃，220rmp振荡培养至od600为2左右，离心收集菌体悬浮于gtebuffer[2.5mmglucose，25mmtris-cl10mmedta(ph8)]中，加入lysozyme至终浓度为10mg/ml，37℃水浴1h。然后加入2倍体积的sds(1.0％)和naoh(0.8m)溶液，轻轻上下倒置6～8次，然后加入1/2体积冰冷的3msodiumacetate(ph4.8)溶液，立刻轻轻上下倒置6～8次，冰上放置4h以上，然后经过等体积苯酚：氯仿：异戊醇(phenol:chloroform:isoamylalcohol)25:24:1抽提2次，70％乙醇沉淀获得bt菌株的质粒dna。然后利用氯化铯cscl梯度密度超速离心纯化质粒dna。
实施例5
bts2160-1菌株质粒dna脉冲场电泳分析
应用于chef
实施例6
bts2160-1菌株的基因组dna提取
bt单菌落接种于7ml的lb液体培养基中，30℃，220rpm培养过夜，按照1％的量转接于盛有50ml的lb培养基的250ml体积的三角瓶中，30℃，220rpm继续培养4小时至od600＝1.0～2.0；离心收集10ml菌体，然后2mljbuffer(0.1mtrishcl(ph8.0)、0.1medta(ph8.0)、0.15mnacl)洗涤沉淀；将沉淀轻悬于2mljbuffer中加入80ul新鲜配制的溶菌酶(50mg/ml),混匀，37℃温育45min；再加入15ulrnase(10mg/ml)，50℃作用15min；接着加入200μlsds(20％)，70℃处理20min；缓慢冷却至37℃，用等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)及氯仿：异戊醇(24：1)各抽提一次，再加入等体积异戊醇混匀置于-20℃下沉淀上清20min，12,000rmp离心10min。70％乙醇洗涤沉淀2次,风干后溶于100ultebuffer(10mmtrishcl(ph8.0)、1mmedta(ph8.0))中，取5uldna样品在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳，gelred核酸染料染色后用紫外分析仪检测。
实施例7
菌株bts2160-1基因组测序及其序列组装：
取菌株bts2160-1基因组dna5ug，利用covaris随机打断至400-600bp，末端补平后在3'末端加a，然后连接illumina的pair-end接头。连接片段进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收500-700bp范围的条带。回收的条带通过10个循环的pcr扩增，富集得到500bp插入片段的pair-end文库。取10ng的文库，在c-bot中进行clustergeneration，然后在illuminahiseq2000中进行双向测序，经过200个循环的测序反应。获得的原始测序数据需要经过过滤处理，产生的reads数据的质量效果利用fastqc进行评价，并根据质控要求对数据进行进一步的质量控制。质控后获得的序列denovo组装由软件abyss(参数kmer25；n,10)完成，运用soapdenovo短序列组装软件(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html；版本：r240)对处理后的reads数据进行组装，经多次调整后主要参数k设置为46。把reads比对到contig上，根据reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化，最终获得82个scaffold(contig)。
实施例8
菌株bts2160-1基因组标准信息分析流程：
基本流程：(1)数据过滤：对测序得到的原始数据进行过滤及统计；(2)组装：运用soapdenovo2短序列组装软件，对处理后的reads数据进行组装；(3)组装结果评价：以ncbi上公布的26个完成基因组测序的bt菌株基因组作为参考序列，对基因组和基因区覆盖度进行评价；(4)蛋白编码基因预测：采用genemarker软件从组装结果中获得基因序列；(5)non-codingrna注释：通过与参考序列rrna比对找到rrna，或rrnammer软件预测rrna；通过trnascan软件预测trna区域和trna的二级结构；通过rfam软件预测srna；(6)重复序列注释：通过repeatmasker软件(使用repbase数据库)和repeatproteinmasker软件(使用repeatmasker自带的转座子蛋白库)两种方法来预测转座子；通过trf(tandemrepeatfinder)软件预测串联重复序列；(7)crispr预测：使用crisprfinder软件，识别crisprs，得到drs和spacers；(8)基因功能注释：利用kaas工具将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息；(9)基因组可视化草图：使用(g–c)/(g+c)的计算方法来进行gcskew分析，同时根据cog的注释结果和基因的位置信息绘出cog注释的基因在基因组上的分布情况，以及gccontent和菌株可能编码的毒蛋白的位置信息。利用cgviewserver完成基因组可视化草图的绘制。
实施例9
菌株bts2160-1总蛋白质谱鉴定
菌株bts2160-1总蛋白质谱鉴定利用线性离子阱结合轨道阱高分辨率组合质谱技术(ltq-orbitrapms)分析。bts2160-1用nb培养基培养72h，每隔4h收集2ml菌液，最后将各时间点收集到的菌液混合，提取总蛋白。利用胰蛋白酶对总蛋白进行酶解消化预处理，然后hplc阳离子交换分离多肽，ziptipc18吸头进行脱盐处理，获得上机检测液。利用easy-nlc结合orbitrap质谱检测样品，质谱采集到的原始数据采用proteomediscovery软件的sequest搜索器进行搜索和匹配，使用bt菌基因组预测的蛋白数据库进行搜索。最后发现，从4h到72h，染色体上表达的总蛋白数量共为1929个，质粒1上有80个表达的蛋白，质粒2上有44个蛋白表达。
实施例10
小菜蛾的人工饲养
小菜蛾利用温室种植的中国白菜进行人工饲养，人工饲养环境的相对湿度为65％左右，温度保持为26℃上下，光照周期为14h:10h。用将饱含10％葡萄糖溶液(或蜂蜜溶液)的脱脂棉球放入成虫饲养笼中，供成虫取食，每天更换一次。蛹羽化后，成虫当天即交配产卵，一条雌性的小菜蛾可以生产250到300枚卵。收集卵直接置于人工饲养中国白菜的叶片上，第5～6天开始孵化，孵化出的幼虫即可以取食叶片，适时不断更换菜叶，5～6天即可以发育成2～3龄幼虫直接用于生物测定。
实施例11
致倦库蚊(culexquinquefasciatus)和白纹伊蚊(aedesalbopictus)的虫源取自于广西壮族自治区疾病预防与控制中心，采取人工室内饲养。饲养环境，温度为26℃，相对湿度在60％以上，光照周期为14h:10h。蚊的生长周期为4个阶段：卵、幼虫、蛹和成虫。幼虫生长在去氯的自来水中，喂饲人工饲料。成虫放置在网状笼中，放入10％的葡萄糖溶液的脱脂棉球喂饲成虫，放入小老鼠让蚊吸血以进入繁殖阶段。一般雌蚊将虫卵产在静止的水中，通常我们在成虫笼中放入一个盛水瓷碗以收集虫卵。虫卵在水中孵化成幼虫，饲养10天左右即可进入2-3龄，即可用于生测。
实施例12
菌株bts2160-1蛋白对小菜蛾的毒性测试
粗蛋白取菌液六个不同浓度梯度被测液，加入0.1％tween20或者tritonx100。选取新鲜的中国白菜叶片(大小一致，20g左右，含有中脉)，用器皿切割成直径为9cm左右的圆菜叶片，均匀地浸入上述待测样品溶液中，20s，取出后在室温下凉干(中间翻转一次)。塑料培养皿中放入一张大小相仿的滤纸，用蒸馏水湿润，再放入晾干的叶片。用毛笔轻轻接入二龄幼虫，每个培养皿中放入小菜蛾10头，每个处理重复3-6次，盖上培养皿，胶布缠好，防止幼虫逃逸。放置25℃光照培养箱中培养，光周期为12h：12h。每天观察，检查菜叶是否腐烂或干枯，是否有水蒸气凝结；第2天和第4天分别调查死、活虫数，利用spss统计分析软件进行毒力回归分析，计算lc50值。结果发现菌株bts2160-1蛋白对小菜蛾并无生物活性。
实施例13
菌株bts2160-1蛋白对致倦库蚊和白纹伊蚊的杀虫活性测试
蚊的生物测定参照who建立的标准程序。标定好浓度的蛋白溶液由除氯自来水稀释成8个浓度梯度，分别置于消毒透明饮水塑料杯里(直径5cm)，每个塑料杯盛30ml的蛋白溶液，用pasteurpipette移入30头3龄的蚊幼虫。以不加入任何蛋白的除氯自来水作为阴性对照，以bti的蛋白作为阳性对照，每个蛋白浓度设置3个重复处理。所有生物测定都在人工恒定的环境，温度为26℃，65％的相对湿度，光照周期为14h:10h，培养48h后，观察蚊幼虫的死、活数量，并做好统计，利用spss统计分析软件进行毒力回归分析，计算lc50值。统计结果显示，菌株bts2160-1蛋白对致倦库蚊(culexquinquefasciatus)三龄幼虫的杀虫活性lc50为5.668ng/ml，菌株bti对致倦库蚊(culexquinquefasciatus)三龄幼虫的杀虫活性lc50为1.718ng/ml，相较而言，bti菌株对于致倦库蚊的活性要高于bts2160-1菌株。菌株bts2160-1蛋白对白纹伊蚊(aedesalbopictus)三龄幼虫的杀虫活性lc50为21.113ng/ml，菌株bti对白纹伊蚊(aedesalbopictus)三龄幼虫的杀虫活性lc50为45.585ng/ml，相较而言，菌株bts2160-1所产生的杀蚊蛋白对于白纹伊蚊(aedesalbopictus)的活性要显著高于bti菌株。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！