本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
豆豉生产历史悠久，是我国早期的大豆发酵食品，但目前豆豉在生产中仍存在很多问题。传统豆豉多为自然发酵和纯种发酵。自然发酵生产的豆豉风味好，但易染杂菌，生产周期长，质量不稳定，受季节限制，而且制作中添加高浓度食盐，对营养成分有破坏作用；纯种发酵缩短了发酵周期，但豆豉的风味单一。所以，研究发酵豆豉的复合菌剂对于现代化豆豉的发展具有重要意义。
豆豉不但是一种调味品，还是一种重要的药食同源物质，其中的营养成分和生理活性物质一部分来源于原料大豆，一部分是由参与发酵微生物的作用产生和转化。一些研究已经表明发酵增强大豆的抗氧化作用，例如发酵豆制品纳豆和豆豉等，与未发酵豆制品相比，均表现出更高的抗氧化活性。豆豉中的抗氧化物质主要包括酚类、黄酮类、肽类及氨基酸类物质。由此可见，豆豉也可以成为一种具有抗氧化活性的功能强化型食品，但是目前对于豆豉的功能性开发还不够深入，所以利用复合菌剂提高发酵豆豉的抗氧化活性，可以为豆豉从单一的调味品转向功能性食品，提供一定的参考与指导。
技术实现要素：
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
一方面，一种提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂，包括复合菌体和辅料；所述复合菌体包括：纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)和异常汉逊酵母(hansenulaanomala)。
进一步的，以体积比计，纳豆芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：保加利亚乳杆菌：酿酒酵母：鲁氏接合酵母：异常汉逊酵母＝1:1:1:1:1:1:1。
进一步的，复合菌体(体积)：辅料(质量)＝5-10:1。
进一步的，辅料包括脱脂奶粉和乳糖。
另一方面，一种提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：从-80℃超低温冰箱中，分别取纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母，分别接种到2ml活化培养基中，过夜培养得到各菌株活化培养液；
(2)将步骤(1)的各菌株活化培养液，按1％(v/v)的接种量分别接种到相对应的扩大培养基中，培养6-12h，得各菌株种母培养液；
(3)将步骤(2)的各菌株种母培养液，按2-5％(v/v)的接种量分别接种到相应的扩菌培养基中，分别培养至菌液在od660nm测得的值大于4，然后分别离心，弃去上清液，用生理盐水重悬沉淀，分别得到纳豆芽孢杆菌菌体悬液、解淀粉芽孢杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液、保加利亚乳杆菌菌体悬液、酿酒酵母菌体悬液、鲁氏接合酵母菌体悬液和异常汉逊酵母菌体悬液；
(4)将纳豆芽孢杆菌菌体悬液、解淀粉芽孢杆菌菌体悬液、枯草芽孢杆菌菌体悬液、保加利亚乳杆菌菌体悬液、酿酒酵母菌体悬液、鲁氏接合酵母菌体悬液和异常汉逊酵母菌体悬液按体积比1:1:1:1:1:1:1比例混合后，添加辅料混合均匀，冷冻干燥后得到复合菌剂。
进一步的，步骤(1)中纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌使用的活化培养基为lb液体培养基，30-37℃培养12-16h。
进一步的，步骤(1)中保加利亚乳杆菌使用的活化培养基为mrs液体培养基，30-37℃培养12-16h。
进一步的，步骤(1)中酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母使用的活化培养基为麦芽汁液体培养基，28-32℃培养12-16h。
进一步的，步骤(2)中纳豆芽孢杆菌活化培养液、解淀粉芽孢杆菌活化培养液和枯草芽孢杆菌活化培养液使用的扩大培养基为lb液体培养基，30-37℃好氧培养。
进一步的，步骤(2)中保加利亚乳杆菌活化培养液使用的扩大培养基为mrs液体培养基，30-37℃厌氧培养。
进一步的，步骤(2)中酿酒酵母活化培养液、鲁氏接合酵母活化培养液和异常汉逊酵母活化培养液使用的扩大培养基为麦芽汁液体培养基，28-32℃好氧培养。
进一步的，步骤(2)中扩大培养得到的各菌株种母培养液中各菌种活菌数均≥106cfu/ml。
进一步的，步骤(3)中纳豆芽孢杆菌种母培养液、解淀粉芽孢杆菌种母培养液和枯草芽孢杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为lb液体培养基，30-37℃好氧培养。
进一步的，步骤(3)中保加利亚乳杆菌种母培养液使用的扩菌培养基为mrs液体培养基，30-37℃厌氧培养。
进一步的，步骤(3)中酿酒酵母种母培养液、鲁氏接合酵母种母培养液和异常汉逊酵母种母培养液使用的扩菌培养基为麦芽汁液体培养基，28-32℃好氧培养。
进一步的，步骤(3)中离心条件为5000rpm离心10-20min。
进一步的，步骤(4)中的辅料包括脱脂奶粉和乳糖。
进一步的，步骤(4)中复合菌体(体积)：辅料(质量)＝5-10:1。
再一方面，一种提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂的应用，包括以下步骤：
称取大豆后洗净，然后将洗净的大豆蒸熟，再用米曲霉复合酶液浸泡蒸熟的大豆，得到酶解大豆；
向酶解大豆中加入上述提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂进行发酵，得发酵豆豉。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的提高发酵豆豉抗氧化活性的复合菌剂，采用多种芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌制成。豆豉在发酵过程中由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌产生的酶系对原料大豆中的大分子物质进行水解，生成大豆低聚肽、苷元型大豆异黄酮等功能物质。同时芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌利用大豆提供的营养物质进一步代谢，产生次级代谢产物，这些代谢产物再经复杂的化学反应，从而赋予豆豉独特的风味和功能。本发明的复合菌剂可以模拟自然发酵豆豉的状态，提高发酵豆豉的风味和功能；与自然发酵豆豉相比缩短生产时间，保证豆豉的食品安全性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1：单菌种菌体的制备
1、实验室保存的益生菌包括：
①芽孢杆菌：纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
②乳酸菌：保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)。
③酵母菌：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)和异常汉逊酵母(hansenulaanomala)。
各菌种采购自工业微生物菌种保藏管理中心及中国普通微生物菌种保藏管理中心，具体订购信息参见表1和表2。
表1中国工业微生物菌种保藏管理中心订购信息
表2中国普通微生物菌种保藏管理中心订购信息
2、芽孢杆菌菌体的制作
(1)菌种的活化、种母的制备及菌体扩培，均使用lb液体培养基。
lb液体培养基组成：1％蛋白胨，0.5％酵母浸粉，1％nacl，ph7.0，121℃，高压灭菌30min。
(2)菌种活化
将保存于-80℃的芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌)分别接种到2mllb液体培养基上，37℃过夜培养14h，得到各菌种的活化培养液。
(3)种母培养
取(2)所述的活化培养液，按1％(v/v)的接种量分别接种于lb液体培养基中，37℃好氧过夜扩大培养6h，得到各菌株种母培养液，各菌种活菌数达到106cfu/ml。
(4)菌体扩大培养
将(3)所述的各菌株种母培养液，按2-5％接种量分别接种到扩菌培养基(lb液体培养基)中，37℃好氧培养，分别培养至菌液在od660nm测得的值大于4，然后分别离心处理，离心条件为5000rpm，10-20min，充分富集菌体，去除培养基(上清)，最后利用生理盐水重悬菌体，得到各菌种的菌体悬液。
3、乳酸菌菌体的制作
(1)菌种的活化、种母的制备及菌体扩培，均使用mrs液体培养基。
mrs液体培养基组成：1％蛋白胨，0.8％牛肉膏，0.4％酵母浸粉，2％葡萄糖，0.5％醋酸钠，0.2％三水磷酸氢二钾，0.2％柠檬酸钠，0.2％硫酸铵，0.02％硫酸锰，0.1％tween80，ph6.2，115℃，高压灭菌30min。
(2)菌种活化
将保存于-80℃的乳酸菌(保加利亚乳杆菌)接种到2mlmrs液体培养基上，37℃过夜培养14h，得到保加利亚乳杆菌的活化培养液。
(3)种母培养
取(2)所述的活化培养液，按1％(v/v)的接种量分别接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧过夜扩大培养8h，得到保加利亚乳杆菌种母培养液，活菌数达到106cfu/ml。
(4)菌体扩大培养
将(3)所述的保加利亚乳杆菌种母培养液，按2-5％接种量接种到扩菌培养基(mrs液体培养基)中，37℃厌氧培养至菌液在od660nm测得的值大于4，然后分别离心处理，离心条件为5000rpm，10-20min，充分富集菌体，去除培养基(上清)，最后利用生理盐水重悬菌体，得到保加利亚乳杆菌的菌体悬液。
4、酵母菌菌体的制作
(1)菌种的活化、种母的制备及菌体扩培，均使用麦芽汁液体培养基。
麦芽汁液体培养基组成：液体麦芽汁培养基含有100ml麦芽汁，1g蛋白胨，20g葡萄糖，ph5.6-6.0，定容到1000ml，ph7.0，115℃，高压灭菌30min。
(2)菌种活化
将保存于-80℃的酵母菌(酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母)分别接种到2ml麦芽汁液体培养基上，30℃过夜培养14h，得到各菌种的活化培养液。
(3)种母培养
取(2)所述的活化培养液，按1％(v/v)的接种量分别接种于麦芽汁液体培养基中，30℃好氧过夜扩大培养12h，得到各菌株种母培养液，各菌种活菌数达到106cfu/ml。
(4)菌体扩大培养
将(3)所述的各菌株种母培养液，按2-5％接种量分别接种到扩菌培养基(麦芽汁液体培养基)中，30℃好氧培养，分别培养至菌液在od660nm测得的值大于4，然后分别离心处理，离心条件为5000rpm，10-20min，充分富集菌体，去除培养基(上清)，最后利用生理盐水重悬菌体，得到各菌种的菌体悬液。
实施例2：复合菌剂的制备
复合菌剂包括：芽孢杆菌菌体(纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)，乳酸菌菌体(保加利亚乳杆菌)和复合酵母菌菌体(酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母)。
将上述复合菌剂中菌株按实施例1制成单菌种菌体悬液，将上述纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母的菌体悬液按照1:1:1:1:1:1:1的体积比混合，制成复合菌体，然后与辅料(脱脂奶粉和乳糖)按5-10:1(v/m)混合均匀，冷冻干燥后得到复合菌剂。
实施例3：复合菌剂的应用
取实施例2制得的复合菌剂，包括：复合芽孢杆菌菌剂(纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)，乳酸菌菌剂(保加利亚乳杆菌)，复合酵母菌菌剂(酿酒酵母、鲁氏接合酵母和异常汉逊酵母)。
添加0.5％质量(以去皮大豆干重计)的复合菌剂发酵大豆，发酵完成后，测定发酵豆豉的抗氧化活性和营养成分。
豆豉发酵工艺如下：
(1)前处理：称取200g去皮大豆，清洗，加入大豆质量3-4倍的水，于37℃浸泡8h，沥干水，用纱布包裹后放入笼屉中，于106℃下蒸豆10min，取出，冷却至室温，加入去皮大豆干物质量0.3％的米曲霉复合酶液，于38℃下泡豆23h，得酶解大豆。
(2)发酵：将复合菌剂按去皮大豆干物质量0.5％的量加入酶解大豆中，接种后在30℃下发酵10天，得发酵豆豉。
实施例4：复合菌剂的应用
添加1％质量的实施例2制得的复合菌剂发酵大豆，发酵完成后，测定发酵豆豉的抗氧化活性和营养成分。
豆豉发酵工艺：
(1)前处理：称取200g去皮大豆，清洗，加入大豆质量3-4倍的水，于37℃浸泡8h，沥干水，用纱布包裹后放入笼屉中，于106℃下蒸豆10min，取出，冷却至室温，加入去皮大豆干物质量0.3％的米曲霉复合酶液，于38℃下泡豆23h，得酶解大豆。
(2)发酵：将复合菌剂按去皮大豆干物质量1％的量加入酶解大豆中，接种后在30℃下发酵10天，得发酵豆豉。
实施例5：复合菌剂的应用
添加1.5％质量的实施例2制得的复合菌剂发酵大豆，发酵完成后，测定发酵豆豉的抗氧化活性和营养成分。
豆豉发酵工艺：
(1)前处理：称取200g去皮大豆，清洗，加入大豆质量3-4倍的水，于37℃浸泡8h，沥干水，用纱布包裹后放入笼屉中，于106℃下蒸豆10min，取出，冷却至室温，加入去皮大豆干物质量0.3％的米曲霉复合酶液，于38℃下泡豆23h，得酶解大豆。
(2)发酵：将复合菌剂按去皮大豆干物质量1.5％的量加入酶解大豆中，接种后在30℃下发酵10天，得发酵豆豉。
分别以实施例3、实施例4、实施例5制作的发酵豆豉为实验材料，对实验材料进行抗氧化活性及营养成分的测定，主要包括：抗氧化活性及可溶性蛋白、有机酸、总酚和总黄酮的含量等，检测结果如表3所示：
表3发酵豆豉抗氧化活性及营养成分检测结果
检测结果表明，本发明所生产的复合菌剂应用于发酵豆豉中，使各实施例发酵豆豉的总酚和总黄酮含量都显著升高，可溶性蛋白含量及六种有机酸含量也明显升高，三种产品都具有较高的抗氧化能力。其中实施例4，即复合菌剂添加量为1％时，发酵豆豉的抗氧化能力最高。
本发明为复合菌剂发酵，通过益生菌芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌的复合作用使大豆的抗氧化活性及营养成分得到了提高，而且发酵过程安全可控，有效地缩短了生产周期。
根据之前关于豆豉发酵过程中起主导微生物筛选的研究，我们得出曲霉、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌是豆豉发酵过程中起主要作用的微生物。豆豉的发酵实质上是不同微生物的共同作用，米曲霉主要是在制曲阶段发挥作用，发酵过程中芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌产生的酶系对原料大豆中的大分子物质进行水解，生成大豆低聚肽、苷元型大豆异黄酮等功能物质。同时芽孢杆菌与乳酸菌、酵母菌利用大豆提供的营养物质进行进一步复杂的代谢作用，产生次级代谢产物，这些代谢产物再经复杂的化学反应，从而赋予豆豉独特的风味和功能。所以本发明采用芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌制成复合菌剂，既可以模拟自然发酵豆豉的状态，提高发酵豆豉的风味和功能，又可以缩短生产时间，保证豆豉安全性。
对于上述技术特征的其他的替代方案，本发明在此不再一一列举。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。