本发明属于分子生物学和生物
技术领域：
：，涉及番茄14-3-3蛋白tft6基因及其酵母双杂交载体的构建方法。
背景技术：
：：14-3-3蛋白序列高度保守，不同家族成员在结构上都表现出极大的相似性，然而不同的家族成员行使不同的功能。他们在代谢、信号转导、胁迫响应、细胞周期调控、植物抗病等方面都具有重要的调控作用(aitken,2006)。蔗糖磷酸合成酶(sucrose-phosphatesynthase，sps)是调控植物碳同化和分配的关键酶之一，其活性高低影响蔗糖的合成能力和光合同化的碳在淀粉和蔗糖之间的分配。是植物中碳水化合物进入糖代谢途径的限速酶，因此该酶在植物生长发育过程中的作用非常关键，14-3-3蛋白通过与sps互作调控sps的活性，从而调控番茄的蔗糖代谢和番茄果实的品质。番茄(solanumlycopersicum)是一种全世界广泛栽培的重要果菜植物(xu与shi,2006)。我国番茄生产位居世界第二位，栽培面积约1627万亩，番茄产量超过5594万吨。随着番茄产业的扩大，提高其果实品质是育种和栽培的主要目标。而糖含量是其品质形成的关键指标之一。蔗糖处于糖类代谢的中心位置(castledenetal,2004)，不但是光合产物的主要运输形式而且还是番茄糖类积累的重要物质。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新的番茄品质调控途径中的14-3-3蛋白基因tft6。本发明的另一个目的是提供含有番茄14-3-3蛋白基因tft6的酵母双杂交载体及其构建方法。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：番茄14-3-3蛋白tft6基因，其dna序列如seqidno.1所示。番茄14-3-3蛋白tft6基因的克隆方法如下：以番茄叶片为材料，利用rnapreppure植物总rna提取试剂盒的方法提取总rna，反转录合成cdna，设计特定引物扩增番茄14-3-3蛋白tft6基因：上游引物p1：5’-ccatggcgtcgccacg-3’下游引物p2：5’-cccgggtcattcattatcatctgg-3’以反转录的cdna为模版，进行聚合链式pcr反应，产物连接到pmd18-t上，转化dh5α感受态细胞，进行序列测定，得到序列如seqidno.1所示的番茄14-3-3蛋白tft6基因。上述的番茄14-3-3蛋白tft6基因，所述的番茄为“中蔬6号”。含有番茄14-3-3蛋白tft6基因的表达载体构建，方法如下：1)提取番茄叶片中的总rna，然后将总rna反转录为cdna；2)以cdna为模版，通过设计的特定引物，pcr扩增得到上游和下游分别导入ncoⅰ和smaⅰ酶切位点的tft6基因；其中，所述的特定引物是：上游引物p1：5’-ccatggcgtcgccacg-3’；下游引物p2：5’-cccgggtcattcattatcatctgg-3’；3)将带有酶切位点的tft6基因，连接到克隆载体pmd18-t上，转化dh5α感受态细胞，提取阳性质粒pmd18-t-tft6；4)限制性内切酶ncoⅰ和smaⅰ分别对阳性质粒pmd18-t-tft6和表达载体pgbkt7进行双酶切，将得到的tft6基因片段插入到表达载体pgbkt7中，构建番茄14-3-3蛋白tft6基因的酵母双杂交载体pgbkt7–tft6；本发明的有益效果：1.本发明构建的含有番茄14-3-3蛋白tft6基因的酵母双杂交表达载体，为首次报道，可直接进行与番茄sps的互作，鉴定番茄14-3-3蛋白对sps的调控作用。2.本发明提供的番茄14-3-3蛋白tft6基因是一个新的番茄品质调控的编码基因。通过试验，tft6基因能够与sps基因直接互作，调控sps的活性，进而影响番茄果实的可溶性糖的含量。附图说明图1为酵母双杂交载体pgbkt7–tft6构建方法示意图；图2为实施例1制备的番茄tft6基因的pcr扩增电泳图；其中，m：2000bpmarker；1，2，3：tft6基因；4：ddh2o对照；图3为引入ncoⅰ和smaⅰ酶切位点的tft6质粒提取与双酶切电泳图；图4为pgbkt7-tft6菌落pcr图；图5为pgbkt7-tft6测序结果比对图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1番茄14-3-3蛋白tft6基因的编码区序列的克隆采用植物材料为“中疏6号”番茄；1.总rna的提取及反转录成cdna，采用植物总rna提取试剂盒的方法，具体如下：(1)匀浆处理：取0.2-0.3g植物样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μlrl和4.5μlβ-巯基乙醇，涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2-5min；小心吸取收集管中的上清至rnase-free的离心管中。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中。(4)向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60s，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中。(5)dnasei工作液的配制：取10μldnasei储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μlrdd溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室温静置15min。(7)向吸附柱cr3中加入350μl的去蛋白液rw1，12,000rpm(～13,400×g)离心60s，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中。(8)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心60s，倒掉废液，将吸附柱cr3放回收集管中。(9)重复步骤(8)。(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃废液，将吸附柱cr3置于超净工作台，开盖吹2-3min，直到无乙醇味为止。(11)将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，在吸附膜的中间部位悬空滴加30μl～100μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，即得到rna溶液。(12)总rna的检测：取上述rna溶液1-5μl按比例加入凝胶加样缓冲液，以0.5×tbe为电泳缓冲液，0.8％非变性琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪中观察凝胶，检测所提取的rna的完整性。(13)cdna第一条链合成总反应体积为25μl：第一步反应加以下溶液按照比例加入ep管中：rna：5μloligod(t)15：1μl然后在条件70℃下，反应5min；接着拿出来立即放在冰上，2min，进行第二步反应。第二步反应按照比例加入以下溶液：然后在37℃条件下，反应1h。以番茄叶片为材料提取总rna，琼脂糖凝胶电泳检测得到2个条带，且28s亮度约为18s亮度的2倍，表明所提取的总rna完整无降解，质量较高，rna纯度很高，蛋白以及其他离子污染较少，可以满足rt-pcr的需要。2.目的基因tft6的克隆(1)引物合成从ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的genbank库中下载tft6的基因序列，利用primer5.0设计引物，委托金唯智生物技术有限公司合成。上游引物p1：5’-ccatggcgtcgccacg-3’；下游引物p2：5’-cccgggtcattcattatcatctgg-3’；(2)tft6基因的扩增pcr加样体系:pcr反应体系：94℃5min30个循环：(3)胶回收纯化pcr产物a：将单一目的dna条带从琼脂凝胶上切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称量计算凝胶重量(提前记录离心管重量)。b：向胶块中加入1倍凝胶体积的bufferpg(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，以此类推)。c：50℃水浴温浴，其间每隔2-3min温和的上下颠倒离心管，带溶胶液为黄色，以确保溶胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。d：柱平衡：向已装入收集管的吸附柱中加入200μlbufferps，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。e：将步骤c所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。f：向吸附柱中加入450μlbufferpw(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。g：重复步骤f。h：13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。i：将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlbuffereb，室温放置2min，13000rmp离心1min，收集dna溶液，-20℃保存dna。番茄tft6基因的pcr扩增电泳图如图2所示，其中，m：2000bpmarker；1，2，3：tft6基因；4：ddh2o对照。以cdna为模板，可见一条约777bp的目的条带；没有出现非特异性条带与预期结果吻合，说明该引物及退火温度的选择较为合适。实施例2：番茄tft6基因的酵母双杂交诱饵载体的构建植物材料为“中疏6号”番茄；1.总rna的提取及反转录成cdna方法同实施例1的步骤1。2.目的基因的连接及热激法转化大肠杆菌将目的dna片段与ta克隆载体(pmd18-t)按连接体系混合，16℃连接30min。连接体系如下：重组克隆载体的转化和蓝白斑的筛选：(1)取5μl连接产物加入到含有50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞的1.5ml离心管中，用移液枪吸打混匀，冰浴30min。(2)然后置于42℃水浴，热激90s，之后快速放回冰盒中，静置5min。(3)在超净工作台上，向1.5ml离心管中加入500μl已预热至37℃的lb液体培养基(不含抗生素)，吸打混匀后，37℃170rmp培养约1h。(4)常温5000rmp低速离心2min。在超净台中弃去300μl上清，再将剩余的菌液重新悬浮，取150μl菌液滴加到固体lb平板培养皿(含50μl50μg.ml-1amp、40ml20mg.ml-1x-gal和16μl0.1mol.ml-1iptg)上，用烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。(5)37℃倒置过夜培养(约14-16h)，直至出现蓝白单菌落；利用蓝白斑进行阳性克隆的筛选，白斑为阳性克隆。3.菌落pcr鉴定过夜培养转化后的平板，然后在平板上挑取单菌落，进行编号，随后进行菌落pcr反应。pcr反应以cdna为模板作为阳性对照，以无菌水为模板作为阴性对照。20μl反应体系如下：菌落pcr程序为：94℃预变性5min30个循环：反应结束后，取5μl反应产物，用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像仪检测扩增产物。将可以扩增出目的片段大小的菌液过夜培养，取约1ml菌液送测序，待序列回来后与原序列blast比对，以确定基因的准确性。检测基因正确后，将测序正确的菌液活化，37℃扩大培养后加甘油至终浓度10％-15％，-80℃冰箱保存备用。4.终载体构建(1)pmd18-t-tft6及pgbkt7质粒的获得用无菌牙签挑取含有目标质粒的e.coli单菌落接种到10ml含有相应抗生素的lb液体培养基中，37℃摇动培养约14h。按照tiangen公司的高纯度质粒小量抽提试剂盒说明书来操作：a：柱平衡步骤：将吸附柱cp3放在收集管中，加入500μl的平衡液bl至cp3内，12,000rpm离心1min后，丢弃收集管内的废液，再将吸附柱放入收集管内。b：吸取1-5ml过夜培养的菌液，将其加入到离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸取出上清液。c：向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液p1，使用移液器或涡旋震荡器彻底悬浮细菌沉淀。d：再向离心管中加入250μl的溶液p2，轻柔缓慢的上下翻转6-8次，以使菌体能够充分裂解。e：向离心管里加入350μl的溶液p3后，要立即轻柔上下翻转离心管6-8次，使其充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。f：用移液器将上一步所收集到的上清液转移至吸附柱cp3中，注意尽量不要吸出沉淀，12,000rpm离心1min，丢弃收集管中的废液，把吸附柱cp3重新放在收集管中。g：加入600μl的漂洗液pw至吸附柱cp3内，12,000rpm离心1min，弃掉收集管里的废液，把吸附柱cp3重新放回收集管中。h：重复步骤g。i：将吸附柱cp3重新放回收集管内，12000rpm离心2min，用以除去吸附柱中残余的漂洗液。j：将吸附柱cp3放在一个干净的离心管里，向吸附膜中间悬空滴加50-100μl的洗脱缓冲液eb，在室温条件下静置2min后，12,000rpm离心2min，获得质粒溶液。取上述所提取好的质粒样品2μl，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，然后在bio-rad凝胶成像系统上观察条带并拍照。质粒置于-20℃保存以进行下一步试验使用。(2)pmd18-t-tft6及pgbkt7质粒的双酶切a：得到质粒后对其及载体pgbkt7双酶切，37℃下反应3h，10μl体系如下：b：电泳检测并回收目的条带，将tft6基因与bd载体连接，10μl体系如下：c：对连接产物进行转化、涂板、pcr检测及测序，得到诱饵表达载体并保存甘油菌。pmd18-t-tft6测序检测成功之后，提取质粒并对其进行双酶切鉴定，之后进行凝胶电泳检测结果如图3所示，有两条带，其中一条在750bp左右且无杂带，说明pmd18-t-tft6双酶切成功；2、3泳道为pgbkt7双酶切结果，1泳道是pgbkt7对照载体。以上结果说明，目的片段及载体均双酶切成功。诱饵载体构建完成后转化，得到的菌落pcr结果所检测到的片段大小为目的片段的大小约为750bp，如图4所示，测序结果如图5所示，核苷酸序列比对完全吻合，说明pgbkt7-tft6诱饵表达载体构建成功。序列表<110>沈阳农业大学<120>番茄14-3-3蛋白tft6基因的酵母双杂交载体的构建<130>2<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>1152<212>dna<213>中蔬6号番茄("mediumandvegetable6"tomato)<400>2cgagagaaaggaagctaaaaaccgctctcactttctctctctagaaaaacaaaaaactct60ctccctctttctctctctaacatcaatggcgtcgccacgcgaggaaaacgtgtacatggc120gaagcttgccgagcaagctgagcgttacgaggagatggtagagttcatggaaaaagttgt180cgctgccgccgatggtgcagaggagttaaccgttgaagaacgaaatctcctctccgttgc240gtataagaatgtgatcggagcacggagagcttcatggaggatcatttcctccattgagca300gaaagaggagagccgtggtaacgaagatcatgttgcttctattaaggaatacagatctaa360gatcgagtctgaacttacctcgatctgtaatggaattcttaagctgcttgattctaagct420cattggctctgctgctaccggtgactctaaggtgttttacttgaaaatgaagggagatta480tcatcgttacttggctgagtttaagaccggtgctgagcgaaaagaagctgctgagaatac540tctctccgcttacaaagctgctcaggatattgcaaatgctgagcttgctcctacacatcc600aatccgattgggacttgctctcaatttctctgtgttttactacgagattttgaattctcc660tgatcgtgcctgtaatctcgccaaacaggcctttgatgaggcaattgccgagttggacac720attgggcgaagagtcctacaaggatagcactctgatcatgcagcttcttcgtgataacct780cactttatggacctctgatatgcaggatgatggaactgatgagatcaaagaagctacacc840taaaccagatgataatgaatgagcagcagtaaaaactggtgaaatttctttaggattgaa900atatgctatgttgtaacttctttttcatttgtctggattcaactctttgttagttctaga960tcttgtgatttgtaatacctaaaatcaaccgtttcttgttaattgttgttcttgtttgtt1020tctatgttgatttgctgttgtatttggattatttcctttttctcaaaggaatgacttact1080gggaagatggatgtaccttttaatccacaaatttgttagcttctccatttcatattacat1140ggtcatagattc1152当前第1页12当前第1页12