本发明属于微生物领域，具体一种来自解淀粉芽孢杆菌sqr9产生的十六碳链脂肪酸类拮抗物质及其应用。
技术背景
抗生素(antibiotics)是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物。抗生素滥用使细菌逐渐产生耐药基因，使抗生素药物效果变差，甚至无效。而且，细菌耐药性可以相互传播的，使细菌耐药性复杂化，因此急需寻找新型抗生素解决现在面临的问题。寻找新型抗生素的传统方法为在不同条件下培养新分离的菌株，再将发酵产品分离纯化，最后鉴定得到新型的抗生素。但随着近些年来基因组测序技术的发展，全基因组数据分析提供了一种发现与活性物质合成相关基因簇的途径。脂肪酸结构简单，但是具有多种生物学活性，其中一个就是可以抑制寄生虫或植物病原菌的生长，具有很好的应用前景。
解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)在自然界中分布广泛，对人、畜无毒无害，不污染环境，具有很高的抗逆能力。研究表明，解淀粉芽孢杆菌具有广谱的抑制真菌和细菌的活性，且生长速度快，稳定性强，是一种理想的生防菌资源。解淀粉芽孢杆菌能分泌多种抗生素类物质，如脂肽类抗生素(surfactin、bacillomycind、fengycin)；聚酮类抗生素(macrolactin、difficidin、bacillaene)；小分子抗生素bacilysin等。
技术实现要素：
本发明的目的要解决的问题是提供一种由解淀粉芽孢杆菌sqr9发酵一种十六碳链脂肪酸类拮抗物质。
本发明的另一目的是提供该拮抗物质的提取分离方法。
本发明的又一目的是提供该拮抗物质的应用。
一种来自解淀粉芽孢杆菌sqr9产生的十六碳链脂肪酸类拮抗物质,结构如下所示:
一种从解淀粉芽孢杆菌sqr9中分离所述的十六碳链脂肪酸类拮抗物质的方法,包括：发酵保藏编号为cgmccno.5808的解淀粉芽孢杆菌sqr9，发酵结束后，将发酵液离心，收集上清液，上清液干燥去除水分后，用甲醇浸提，浓缩浸提液得浸膏；浸膏上硅胶柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为20:1的洗脱液；将氯仿-甲醇20:1洗脱液去除溶剂后用甲醇溶解，进一步运用mplcods色谱柱用甲醇-水梯度洗脱，收集体积分数80％甲醇-水洗脱液进一步运用反相hplc法进行深入的分离纯化，在乙腈-水65:35，流速2ml/min，检测波长为210nm,rt＝12.1下得到所述的十六碳链脂肪酸类拮抗物质。
发酵保藏编号为cgmccno.5808的解淀粉芽孢杆菌sqr9的发酵培养基优选landy培养基。
解淀粉芽孢杆菌sqr9的发酵方法优选包括：按1％的接种量将sqr9种子液转接到新鲜的landy培养基锥形瓶中，37℃，170rpm，12h；再将培养后的菌液接种到7l的小型发酵罐中，发酵罐中填充5l的landy培养基，37℃，200rpm培养12h；将7l发酵罐中的菌液接种到150l发酵罐中，发酵罐中填充100l的landy培养基，开始时转速为30℃，转速200rpm，溶氧值75，消泡剂为聚醚类化合物，当溶氧值开始降到30以下时，逐渐提高转速，最高为500rpm，同时增加通气量，将溶氧值保持在10以上，直至od600＝15，此时将转速调至200rpm，通气量降低至最小，保持od，菌液进入稳定期，开始大量产生次级代谢产物，发酵24h。
作为本发明方法的优选：所述的浸膏加甲醇使充分溶解，溶解液加等质量100～200目硅胶使充分混合，减压浓缩干燥即得拌样硅胶；另称取2倍浸膏质量的100～200目硅胶置于玻璃色谱柱当中作为分离硅胶，以氯仿-甲醇体积比为1:0；100:1；80:1；60:1；40:1；20:1梯度洗脱。
作为本发明方法的优选,所述的方法还包括对反相hplc法分离到的活性组分通过凝胶色谱进行分离去除无活性的杂质，最后得到所述的十六碳链脂肪酸类拮抗物质的纯品。
本发明所述的十六碳链脂肪酸类拮抗物质在抑制植物病原真菌及病原细菌生长中的应用。
所述的病原细菌优选革兰氏阳性细菌。
所述的十六碳链脂肪酸类拮抗物质进一步优选在抑制黄瓜尖孢镰刀菌、菌核菌、香蕉尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、马铃薯立枯丝核菌、禾谷丝核菌及茄科劳尔菌、金黄色葡萄球菌生长中的应用。
有益效果:
本申请从解淀粉芽孢杆菌sqr9的全基因中得到一段84kb的未曾被报道的基因序列，为一个水平转移基因岛，根据其在基因组的位置命名为gi3。通过基因敲除及生长抑制实验，验证物质的活性，摸索了物质发酵最适培养基及培养条件，并分离纯化出一种十六碳链脂肪酸拮抗物质c17h34o3，鉴定出物质的分子结构。经验证，该拮抗物质能抑制黄瓜尖孢镰刀菌、菌核菌、香蕉尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、马铃薯立枯丝核菌、禾谷丝核菌及茄科劳尔菌的生长,抑菌谱广。
生物保藏信息
sqr9，分类命名为解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年2月27日，保藏号为cgmccno.5808。
具体实施方式
本发明公开了一种新型脂肪酸拮抗物质，本领域技术人员可以参考本文内容，适当改进参数实现。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：验证本发明所述的脂肪酸对同源菌株的生长抑制活性：
解淀粉芽孢杆菌sqr9基因岛gi3为一个基因水平转移基因岛，位于sqr9基因组核苷酸序列第657050-738610位，gi3包含的基因在同源菌株的相同位置是不存在，推断该基因岛gi3合成的活性物质是与同源菌株相关。为了研究sqr9中基因岛gi3的功能，采用双交换同源重组的方法对基因岛进行了全敲除。首先采用融合pcr的方法将氯霉素(cm)抗性筛选标记的基因与待敲除基因的上下游同源臂融合起来，将融合片段转入感受态sqr9中，37℃，100rmin-1复苏培养8h后将菌悬液涂布于lb平板(cm5μgml-1)，挑转化子验证，得到正确突变体△gi3。将菌株sqr9与△gi3接到landy培养基(landy培养基，1l培养基的配法为：1、葡萄糖40g，单独灭菌,115℃，30min。2、mgso4·7h2o0.5g；kh2po41g；kcl0.2g；mnso4·h2o10mg；feso4·7h2o5mg；cuso4·5h2o0.2mg；酵母粉1g；l-丙氨酸2mg；l-谷氨酸5g，用5m的naoh调制ph＝6.7后,115℃，30min灭菌。1、2分别灭菌后混合在一起)中，30℃，200rpm培养72小时。将发酵液4℃，12000r/min离心10min除去菌体。上清发酵液冷冻干燥去除水分，用甲醇浸提得到粗提物(50ml甲醇：1l的发酵液)。将粗提物过0.22um的无菌有机相滤膜，去除沉淀、杂质及菌，保存在-20℃中。sqr9粗提液为实验组，△gi3粗提液为对照组。
选择了解淀粉芽孢杆菌的模式菌株fzb42，在lb培养基上进行菌落对峙实验。首选在lb培养基的平板上均匀的喷洒上fzb42的菌液，自然风干后，在相应位置放置牛津杯。牛津杯中分别加入100ul实验组及对照组的粗提物。4℃静置8小时后，放入37℃培养24h后，观察实验结果。
表1野生型sqr9与突变体△gi3对同源菌株fzb42的生长抑制作用
实验结果如表1所示，野生型sqr9可以抑制fzb42的生长，但随着突变体△gi3失去合成这种物质的功能后，对fzb42的生长抑制效果完全消失，说明基因岛gi3合成的物质是针对与sqr9的同源菌株解淀粉芽孢杆菌类的。
实施例2：制备并分离纯化本发明所述的脂肪酸拮抗物质：
突变体△gi3只敲除掉基因岛gi3，使突变体△gi3无法再合成该申请中提到的十六碳链脂肪酸类，即c17h34o3，而不影响sqr9中其他活性物质的合成，所以实验组与对照组差异即为c17h34o3的生物活性。实施例1中突变体△gi3对fzb42的生长抑制效果完全消失，因此我们可以通过活性跟踪的方式对△gi3合成的十六碳链脂肪酸类进行分离纯化，即分离的每一步都验证对fzb42的生长抑制活性，有活性的组分再进一步分离纯化。
首先准备种子液：挑取sqr9单菌落于landy培养基的试管中，170rpm，37℃，12h。按1％的接种量将种子液转接到新鲜的landy培养基锥形瓶中，37℃，170rpm，12h。再将培养后的菌液接种到7l的小型发酵罐中，发酵罐中填充5l的landy培养基，37℃，200rpm培养12h。将7l发酵罐中的菌液接种到150l发酵罐中，发酵罐中填充100l的landy培养基。开始时转速为30℃，转速200rpm，溶氧值75，消泡剂为聚醚类化合物。当溶氧值开始降到30以下时，逐渐提高转速，最高为500rpm，同时增加通气量，将溶氧值保持在10以上，直至od600＝15，此时将转速调至200rpm，通气量降低至最小，保持od，菌液进入稳定期，开始大量产生次级代谢产物，发酵24h。
发酵结束后，发酵液12000rpm离心去除菌体，收集上清液，约90l。上清液干燥后，用甲醇浸提，浸提后，旋转蒸发，得到浸膏123克。加适量甲醇使充分溶解，溶解液加等量硅胶(123克，100～200目)使充分混合，减压浓缩干燥即得拌样硅胶。另称取2倍量(246克)上述所用硅胶置于玻璃色谱柱当中作为分离硅胶，以氯仿-甲醇(体积比1:0；100:1；80:1；60:1；40:1；20:1；10:1；0:1)梯度洗脱，收集各个梯度洗脱液验证对解淀粉芽孢杆菌fzb42的抑菌活性(方法参考实施例1)，洗脱液20:1具有较强活性，将20:1洗脱液去除溶剂得到活性组分(1.50克)。上一步收集的20:1组分用适量甲醇溶解后，采用tlc分别对所得浸膏进行检识，硫酸乙醇显色，判断活性组分浸膏所含成分特点为长链脂肪酸；tlc验证后，将20:1组分进一步运用mplcods色谱柱用甲醇：水(体积比30:70；50:50；60:40；70:30；80:20；90:10；100:0)依次梯度洗脱，收集80％甲醇-水洗脱液进一步运用反相hplc法进行深入的分离纯化，在乙腈-水(65:35)，流速2ml/min，检测波长为210nm,rt＝12.1下得到活性较为显著的化合物fg-80％-(2)。fg-80％-(2)对解淀粉芽孢杆菌fzb42有很好的抑菌活性(方法参考实施例1)。又通过凝胶色谱(85％甲醇)进行分离去除无活性的杂质，最后得到活性组分的纯品。对活性组分进行了质谱和nmr(包括二维核磁共振结构解析)测试，最终活性化合物为长链饱和脂肪酸类化合物，分子结构如下所示:
最终分离纯化鉴定出长链饱和脂肪酸拮抗物质的化合分子式为c17h34o3，不饱和度是1，符合长链脂肪酸特征。c17h34o3的质朴为[m+h–h2o]+＝269,[m+h]-＝287,[m+na]+＝309,[m+k]+＝325。1hnmr(600mhz,cd3od)δ0.86(3h,d,j＝7.2hz),0.9(3h,t,j＝7.8hz)，1.32(19h,m),1.41-147(2h,m),1.59(2h,m),2.27(2h,t,j＝7.2hz),3.43(1h,m).13cnmr(150mhz,cd3od)δ13.16(ch3),14.82(ch3),26.99(ch2),27.99(ch2),28.33(ch2),31.14(2ch2),31.32(2ch2),31.48(ch2),31.62(ch2),31.74(ch2),35.87(ch2),36.27(ch2),42.37(ch),76.3(-och),178.55(-cooh)。计算最终确定该化合物的分子式为c17h34o3，误差为(9.9ppm)。
实施例3：验证本发明所述的脂肪酸对植物病原菌的生长抑制活性：
选取的7株病原真菌与一株病原细菌验证分离的长链饱和脂肪酸溶液(100μg/ml)拮抗活性。选取的7株病原菌分别是：
黄瓜尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen，本实验室分离)、
菌核菌(sclerotiniasclerotiorum，本实验室分离)、
香蕉尖孢镰刀菌(fusariumoxysporumschl，本实验室分离)、
辣椒疫霉(phytophthoracapsici，acccno.36278)、
马铃薯立枯丝核菌(rhizoctoniasolaniktihn，acccno.36246)、
禾谷丝核菌/小麦纹枯病菌(rhizoctoniacerealis，acccno.37393)、
玉米茎腐串珠镰孢菌(fusariumverticillioides，本实验室分离)
茄科劳尔氏菌(ralstoniasolanacearum，本实验室分离)
真菌病原菌对峙实验，首先将病原菌接种到pda培养基上，放置于30℃，待菌丝长直径约1cm后，再讲牛津杯置于培养基上，距离菌丝边缘3cm处。牛津杯中加入100ul分离的长链饱和脂肪酸溶液(100μg/ml)。再将平板置于30℃培养箱中，直至病原菌菌丝长满整个平板。细菌病原菌是在na培养基平板上均匀的喷洒上细菌病原菌切克劳尔氏菌，然后将牛津杯置于平板上，牛津杯中分别加100ul分离的长链饱和脂肪酸c17h34o3溶液(100μg/ml)，4℃放置过夜，然后放置于30℃培养箱中24小时。
表2长链饱和脂肪酸c17h34o3对植物病原菌的生长抑制作用
实验结果如表2所示，分离的长链饱和脂肪酸溶液(100μg/ml)对黄瓜尖孢镰刀菌、菌核菌、香蕉尖孢镰刀菌、马铃薯立枯丝核菌、禾谷丝核菌、玉米茎腐串珠镰孢菌及茄科劳尔菌有很强的生长抑制活性。
实施例4：验证本发明所述的脂肪酸对金黄色葡萄球菌的生长抑制活性：
从中国农业科学学院菌种保藏中心获得两株菌株，acccno.01337金黄色葡萄球菌及acccno.10449金黄色葡萄球菌金黄亚种。首选在lb培养基的平板上分别均匀的喷洒上01337金黄色葡萄球菌及10449金黄色葡萄球菌金黄亚种的菌液，吹干后，放置牛津杯，牛津杯中分别加100ul分离的长链饱和脂肪酸c17h34o3溶液(100μg/ml)。4℃静置8小时后，放入37℃培养12h，观察实验结果。
表3长链饱和脂肪酸c17h34o3对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用
实验结果如表3所示，分离的长链饱和脂肪酸溶液(100μg/ml)对金黄色葡萄球有着很强的生长抑制活性，使金黄色葡萄球完全不能生长。