一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法与流程

本发明涉及一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术：

阪崎克罗诺杆菌(cronobactersakazakii)，原阪崎肠杆菌(enterobactersakazakii)，是一种含周身鞭毛、能运动并兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢的粗短杆菌。该菌可引起婴幼儿死亡，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，报告病例的病死率达20％～50％，幸存者常有严重的神经系统后遗症。阪崎克罗诺杆菌是婴儿配方乳粉主要的微生物安全指标，阪崎克罗诺杆菌的检测与控制已经成为影响婴儿食品安全的重要因素。因此建立一种高效、快速的检测方法尤为重要。

与传统的基于微生物培养的检测方法相比，聚合酶链反应(pcr)是细菌检测的一个里程碑，pcr反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它最大特点就是能将微量的dna大幅增加。因此从理论上来说，很少的菌就能在很短的时间内被检测到。然而当pcr用于检测阪崎克罗诺杆菌的主要污染源奶粉时，由于奶粉中的基质比较复杂，使得获得的dna纯度不高，含有较多的脂肪蛋白质等物质，而这些物质会对pcr产生强烈的抑制作用，进而在pcr过程中会出现即使菌体dna浓度很高，也仍然扩不出条带的现象，因此在pcr之前进行样品的分离富集是非常有必要的。对样品的分离富集的方法比较常见的是免疫磁分离技术，但是免疫磁分离技术需要特异性的抗体，抗体制备难度非常大、成本高等问题都限制了它的发展。同时pcr技术还有一大急需解决的问题，即通过pcr的检测结果需经过琼脂糖凝胶电泳来观察结果，此方法需要复杂昂贵的大型仪器，同时需要使用易制毒的染色剂eb，除此之外，此方法耗时长，步骤繁琐，包括制胶、点样、跑电泳等过程，整个过程至少需要一个小时的时间。

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团如氨基，能同核酸发生吸附反应。纳米金比色法是通过纳米金聚集前后，吸收峰发生红移而导致的胶体金颜色变化来观察pcr扩增的结果。

cn105950471a公开了一种基于免疫磁珠技术快速捕获克罗诺杆菌的方法及应用，该方法利用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌菌体，该方法中存在抗体成本高，灵敏度低，检测耗时长等缺点。

技术实现要素：

为解决现有技术中基于免疫磁珠技术捕获克罗诺杆菌的方法需要特异性的抗体，而抗体制备难度非常大、成本高，不适用于批量现场检测的问题，本发明提供了一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法，该方法是将基质中的菌进行破碎，用氨基磁珠捕获释放出的dna后进行pcr扩增，扩增产物与dna探针修饰的胶体金进行杂交，最终通过加盐后胶体金颜色的变化直接肉眼观测检测结果。

本发明所述方法包括如下步骤：

1)将待检物质中所含菌的菌体细胞进行破碎处理释放出dna，萃取除杂后获得粗提dna溶液，

2)向步骤1)的粗提dna溶液中加入活化好的氨基磁珠，孵育捕获粗提dna溶液中的dna；

3)建立阪崎克罗诺杆菌的特异性pcr扩增反应，以步骤2)捕获到的dna为模板进行pcr扩增，获得pcr产物；

4)设计阪崎克罗诺杆菌的dna探针，将胶体金与dna探针进行孵育，然后加入磷酸缓冲液进行老化，获得胶体金探针；

5)将步骤3)获得的pcr产物与步骤4)获得胶体金探针进行混合杂交，然后加入mgso4溶液后5min内观察颜色变化，若溶液仍呈现红色表明该待检测物质中含有阪崎克罗诺杆菌，若溶液由红色变成蓝紫色表明该待检测物质中不含有阪崎克罗诺杆菌。

进一步地，步骤1)是将待检物质离心后重悬于ph为4-11的tebuffer溶液中，添加0μl-50μl蛋白酶k孵育，然后在90℃-100℃下高温处理后进行冰浴，再用体积比为25:24:1的苯酚-氯仿-异戊醇溶液进行萃取，获得粗提dna溶液。其中离心条件可以为4℃、6000g、20min，蛋白酶k的孵育条件可以为56℃、30min，高温处理时间可以为10min，冰浴时间可以为8min。

更进一步地，所述tebuffer溶液的ph为9。该条件下效果最好。

更进一步地，所述蛋白酶k的添加量为30μl。该条件下效果最好。

进一步地，步骤2)所述活化好的氨基磁珠的添加量为：每10ml粗提dna溶液中加入0.1mg活化好的氨基磁珠。如向粗提的dna溶液中加入0.1mg，5ml/mg的活化的磁珠。

进一步地，步骤2)所述孵育捕获是在40℃-80℃下孵育捕获15min-1h。其中在60℃下孵育30min，效果最好。

进一步地，步骤3)所述阪崎克罗诺杆菌的特异性pcr扩增反应中引物对的核苷酸学列如seqidno.1和seqidno.2所示；步骤4)所述阪崎克罗诺杆菌的dna探针的核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步地，步骤4)所述胶体金按照每900μl胶体金对应0.5nmol阪崎克罗诺杆菌dna探针进行孵育，其中胶体金的直径为15nm。

进一步地，步骤4)所述孵育是在50℃、150rpm的条件下孵育22h。

进一步地，步骤4)所述加入磷酸缓冲液进行老化是：先加入100μl0.1m磷酸缓冲液，然后分多次缓慢加入0.01m的磷酸缓冲液，使最终胶体金探针溶液中nacl的浓度达到0.7m，其中0.1m磷酸缓冲液的成分为：0.1mna2hpo4，0.1mnah2po4，0.1％(m/v)sds，ph为8；0.01m磷酸缓冲液的成分为：0.01mna2hpo4，0.01mnah2po4，2mnacl，0.01％(m/v)sds，ph为8。

进一步地，步骤5)所述胶体金探针与pcr产物的体积比为3:7-7:3。

更进一步地，步骤5)所述胶体金探针与pcr产物的体积比为5:5。

进一步地，步骤5)所述mgso4溶液的浓度为150mm-350mm，添加量为5μl。

更进一步地，步骤5)所述的mgso4溶液的浓度为300mm，添加量为5μl。

进一步地，步骤5)所述的杂交时间为5min。

本发明所述待测物质可以为阪崎克罗诺杆菌纯培养物、乳或乳制品，每次所需检测量为10ml。

本发明中胶体金的直径只能采用15nm，如果换成其他其它粒径的胶体金，和dna探针结合量会大幅度降低。

本发明方法的检测原理：

氨基磁珠捕获dna的原理是基于磁珠表面修饰的氨基基团通过静电相互作用和氢键作用结合dna；胶体金比色法是利用了粒径为5-20nm的纳米金溶胶由于表面等离子体共振效应在520nm波长下具有明显的吸收峰，溶液颜色显红色。当在高盐溶液下，纳米金发生聚集，吸收峰会发生红移，溶胶颜色会变为紫色甚至蓝色。当在纳米金表面标记靶基因探针，探针将会和致病菌dna杂交，从而使在高盐状态下，溶液仍呈红色。

首先将待检测物质中所含有的全部菌的菌体细胞进行破碎，使dna被释放出来，然后通过萃取初步除去蛋白质、脂肪等杂质获得粗提dna溶液；利用活化后的氨基磁珠通过氢键作用和静电相互作用捕获粗提dna溶液中存在的dna，然后将捕获后的dna进行阪崎克罗诺杆菌的特异性pcr扩增反应，此时如果捕获的dna中含有阪崎克罗诺杆菌dna则该dna将会被特异性扩增，若捕获的dna中不含有阪崎克罗诺杆菌dna则不会获得特异性扩增片段；通过将阪崎克罗诺杆菌的dna探针标记在胶体金上获得胶体金探针；然后将pcr扩增后的产物与胶体金探针进行杂交，若待检基质中不含有阪崎克罗诺杆菌，则氨基磁珠捕获的dna中则不含有阪崎克罗诺杆菌dna，在阪崎克罗诺杆菌的特异性pcr扩增反应过程中也不会被扩增，即pcr扩增产物中不含有阪崎克罗诺杆菌dna，在pcr扩增产物与胶体金探针杂交过程中，由于体系中不存在阪崎克罗诺杆菌dna而无法与胶体金探针进行杂交，加入硫酸镁溶液后，胶体金会在高盐溶液下，发生聚集，吸收峰会发生红移，溶胶颜色会变为蓝紫色(包括蓝色或紫色)；若待检基质中含有阪崎克罗诺杆菌，则氨基磁珠捕获的dna中则含有阪崎克罗诺杆菌dna，在阪崎克罗诺杆菌的特异性pcr扩增反应过程中也会被扩增，即pcr扩增产物中含有阪崎克罗诺杆菌dna，在pcr扩增产物与胶体金探针杂交过程中，阪崎克罗诺杆菌dna与胶体金探针进行杂交互补，使得加入硫酸镁溶液后，胶体金探针在高盐情况下受到保护，不会产生胶体金沉淀，使得最终的检测结果为红色。在实际检测过程中，可能会出现因为菌的浓度相对较低，而出现部分胶体金沉淀呈紫红色现象，或者会出现在pcr产物和硫酸镁溶液加入后，红色会因为稀释作用轻微变淡的现象，但是上述这些颜色仍然能和阴性有较为明显的差别。

由于磁珠可以在复杂的基质中捕获出dna，并通过磁珠的磁性使其被分离出来，因而可以在复杂的乳基质中实现较高的灵敏度；特异性的pcr扩增引物决定了此方法良好的特异性；氨基磁珠捕获的菌体dna进行特异性的pcr扩增后，通过胶体金比色法可以实现快速的肉眼观测，比色过程在10min内就可以实现，同时也避免了大型仪器的使用；同时本实验直接通过磁珠对dna进行捕获，避免了免疫磁珠方法中抗体的使用，大大降低了实验的成本，也避免了制备抗体的难度。以上特质特点，决定了此方法可以广泛应用于检测机构、企业。同时此检测技术有开发成试剂盒的前景，同时也有潜力可以实现多重检测，整个过程耗时短，成本低，可以实现肉眼观察，故也可以满足基层单位的需要。因此，此方法具有良好的应用前景，并有能力带来可观的经济效益。在学术方面，磁珠捕获核酸法与胶体金比色法的结合技术快速检测克罗诺杆菌弥补了免疫磁捕获方法的抗体制备难成本高的缺点，突破了琼脂糖凝胶电泳方法耗时长、仪器复杂以及使用易制毒试剂的问题，大大缩短了检测时间，降低了成本。

本发明有益效果：

现有技术中存在利用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌的方法，该方法中必须使用单克隆抗体才能实现菌体的捕获，单克隆抗体制备难度大，成本高，而本发明方法通过采用氨基磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌的dna，通过氨基磁珠和阪崎克罗诺杆菌dna之间的氢键作用和静电相互作用，使目标dna能在复杂的基质中被氨基磁珠直接捕获，相比于现有方法，本发明方法直接用氨基磁珠捕获菌dna，无需任何抗体，省略了抗体，克服了免疫磁捕获方法中抗体制备难、抗体成本高的问题，同时，本发明前处理过程只需要1-2个小时，而传统前增菌需要3-5天，克服了传统方法的前增菌时间长的弊端，大大缩短了前处理时间。

现有技术中存在的利用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌的方法，该方法需要进一步结合涂布法计数或结合分子学扩增方法后通过琼脂糖凝胶电泳才能获知最终的检测结果，而本发明采用胶体金比色法，通过纳米金聚集前后吸收峰发生红移而导致的胶体金颜色变化的特点，只需要十分钟，即可通过肉眼观察最终的颜色判定，无需进一步结合其他操作，不需要专业的检测人员与设备即可得到最后结果，进而实现快速检测的目的，解决了传统的平板计数方法中耗时长步骤繁琐的问题，也解决了常用的琼脂糖凝胶电泳方法中需要复杂昂贵的大型仪器，同时需要使用易制毒的染色剂eb的问题。

本发明方法在胶体金探针制作加盐老化的过程中没有直接使用传统的制备过程中常见的0.8m或1m的终浓度，而是将加盐的最终浓度控制在0.7m，获得的胶体金探针性质更稳定，呈色更好。

现有技术中在制备胶体金探针的过程中，通常会在加盐老化后孵育4-5h，以获得稳定性高，呈色更好的胶体金探针，而本发明在实验过程中意外发现，省略该孵育过程，制备的胶体金探针的呈色效果更好，克服了现有技术中在制备胶体金探针的过程中，必须在加盐老化后孵育4-5h才能获得稳定性高，呈色好的胶体金探针的偏见。

本发明方法操作步骤简单，无需昂贵试剂，成本低廉，适用于批量检测。本发明方法适用于具有复杂基质的待检测样品，如奶粉，牛乳等，能够有效避免复杂基质中的复杂成分的影响，实现快速富集菌体dna。

本发明方法结合了磁珠捕获核酸法和胶体金比色法，建立了完整的检测体系，取得了预料不到的技术效果：针对纯培养物中阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度达到10¹cfu/ml，乳中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度达到10²cfu/ml，相比于现有的用阪崎克罗诺杆菌的单克隆抗体和羧基磁珠进行共价偶联获得免疫磁珠直接捕获阪崎克罗诺杆菌的方法灵敏度提高10倍；同时本发明方法步骤简单，特异性好，用时较短，整个检测体系在短短5个小时内就可以全部完成，大大缩短了检测时间，可以实现快速检测；本发明为致病菌的检测提供了一个全新的方式，成为可以替代传统检测方法的新技术。

附图说明

图1为tebuffer的ph值确定；

(m，dnamarkerd2000；0，空白对照；1，ph4；2，ph5；3，ph6；4，ph7；5，ph8；6，ph9；7，ph10；8，ph11)。

图2为蛋白酶k添加量的确定；

(m，dnamarkerd2000；0，空白对照；1，0μl；2，10μl；3，20μl；4，30μl；5，40μl；6，50μl)。

图3为捕获孵育时间的确定；

(m，dnamarkerd2000；1，15min；2，30min；3，1h；4，2h；5，3h；6，4h；7，5h)。图4为捕获孵育温度的优化；

(m，dnamarkerd2000；1，40℃；2，50℃；3，60℃；4，70℃；5，80℃；6，90℃)。图5为mgso4浓度的确定。

图6为胶体金探针与pcr产物体积比确定。

图7为不同浓度的纯菌液检测结果；

(m，dnamarker；1-8，菌液浓度分别为3.5×10⁷cfu/ml，3.5×10⁶cfu/ml，3.5×10⁵cfu/ml，3.5×10⁴cfu/ml，3.5×10³cfu/ml，3.5×10²cfu/ml，3.5×10¹cfu/ml，3.5×10⁰cfu/ml)。

图8为乳体系中不同浓度的的菌液检测结果；

(m，dnamarker；1-8，菌液浓度分别为3.5×10⁸cfu/ml，3.5×10⁷cfu/ml，3.5×10⁶cfu/ml，3.5×10⁵cfu/ml，3.5×10⁴cfu/ml，3.5×10³cfu/ml，3.5×10²cfu/ml，3.5×10¹cfu/ml)。

图9为特异性试验检测结果；

(m，dnamarker；1-3，3株阪崎克罗诺杆菌；4，产气肠杆菌atcc13048；5，阴沟肠杆菌atcc13047；6，大肠杆菌cmccb4413；7，单增李斯特菌cmcc54006)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

1材料与方法

1.1主要菌株

本实验所用菌株如下表1所示：

表1菌种信息

阪崎克罗诺杆菌标准菌株atcc29544，atcc29004，atcc12868，产气肠杆菌atcc13048，阴沟肠杆菌atcc3503，大肠杆菌cmccb4413，单增李斯特菌cmcc54006，分别购自美国模式培养物集存库atcc和中国医学微生物菌种保藏中心cmcc。

1.2实验方法

1.2.1菌株的培养

取阪崎克罗诺杆菌atcc29544作为标准菌株，2株阪崎克罗诺杆菌参考菌株及其他4株非阪崎克罗诺杆菌分别活化培养于nb液体培养基中，37℃培养过夜，即得到处于对数生长期的阪崎克罗诺杆菌菌液，以用于后续实验。

1.2.2氨基磁珠捕获检测体系中dna

取10ml待检样品在4℃以6000g的转速离心20min，将沉淀重悬于含有5％(w/v)tritonx-100的500μltebuffer(10mm，含有1.0mmedta，ph9)中，向其中加入30μl蛋白酶k，在56℃条件下孵育30min，煮沸10min后迅速冰浴8min，再通过苯酚-氯仿-异戊醇溶液(体积比25:24:1)进行萃取，得到粗提的dna溶液。

本实验中所用的氨基磁珠购于洛阳惠尔纳米科技有限公司，活化过程按照说明书中所述：使用前请将磁珠悬浮液充分混匀，取100μl磁珠悬浮液(含磁珠1mg)，磁分离弃上清；2.加入1mlpbs(0.01m，ph7.4)洗涤磁珠，重复洗涤一次；在上述200μl磁珠悬浮液中，加入800μl25％(g/g)戊二醛，室温条件下，在样品混合仪上震荡活化1h；磁分离，弃上清；用1mlpbs清洗活化的磁珠3次；将活化的磁珠分散在200μlpbs中，得到活化的磁珠悬浮液。

向粗提的dna溶液中加入0.1mg，5ml/mg的活化的磁珠，在60℃温度下孵育摇动30min，用tebuffer清洗三次后，重悬100μl用于后续检测。

1.2.3pcr反应体系的建立

针对阪崎克罗诺杆菌esa_04347-esa_04349基因建立pcr反应体系，引物f3和b3序列见表2。pcr反应结束后取5μl扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳。pcr反应体系如表3：

表2pcr引物

表3pcr反应体系

反应循环参数如下：94℃预变性3分钟，

1.2.4胶体金探针的制备

试验所用的dna探针核苷酸序列如seqidno.3所示，具体序列为(5’-3’)aaaaaaaaaatcgtgctgcgagtttgagagactctgacacaccgcg。将900μl胶体金与0.5nmoldna探针在50℃，150rpm条件下孵育22h后转入0.1m磷酸缓冲液(0.1mna2hpo4，0.1mnah2po4，0.1％(m/v)sds，ph为8)，分多次缓慢加入ph为8的0.01m磷酸缓冲液(0.01mna2hpo4，0.01mnah2po4，2mnacl,质量浓度为0.01％(m/v)的sds)进行老化，直至最终胶体金探针溶液中nacl浓度达到0.7m，老化后以20000g的转速离心30min，去除上清液，将沉淀洗涤两次，以除去没有结合的dna探针，最终将沉淀重悬在100μl的ph为8的0.01m磷酸缓冲液(0.01mna2hpo4，0.01m的nah2po4，0.7m的nacl,0.01％(m/v)的sds)中。

1.2.5胶体金比色法观测检测结果

取5μlpcr扩增产物与5μl制备好的胶体金探针混合，室温下静置5min，再向体系中加入5μl，300mm的mgso4溶液，室温下静置5min后观察胶体金颜色变化。

1.2.6磁捕dna结合胶体金比色法检测阪崎克罗诺杆菌的灵敏度

取1ml处于对数生长期的阪崎克罗诺杆菌纯培养液，用0.85％(m/v)生理盐水进行10倍梯度稀释10⁰-10⁸倍，并采用稀释平板法计算出初始菌液浓度为3.5×10⁸cfu/ml。用上述方法分别对不同浓度的阪崎克罗诺杆菌进行捕获和扩增，取5μl扩增产物通过胶体金比色法观察实验结果。

1.2.7磁捕dna结合胶体金比色法检测人工污染奶粉中阪崎克罗诺杆菌

奶粉购自当地超市，人工染菌前经国标法确认不含有阪崎克罗诺杆菌。按照gb/4789402010，取25g奶粉样品放入盛有225ml灭菌水的无菌均质袋中，制成1：10稀释液。添加10⁸cfu/ml-10¹cfu/ml不同稀释度的阪崎克罗诺杆菌纯菌液1ml分别于9组9ml稀释液中，均质后阪崎克罗诺杆菌浓度即为10⁷cfu/ml-10⁰cfu/ml，用上述方法分别对人工污染奶粉中不同浓度的菌液进行捕获和扩增，取5μl扩增产物通过胶体金比色法观察实验结果。

2结果与分析

2.1tebufferph值的确定

本试验基于1.2.2所述的方法，针对其中tebuffer的ph值进行了梯度优化，8组试验的ph值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，再分别对捕获后的dna进行扩增和琼脂糖凝胶电泳。

结果如图1所示，静电相互作用可能是影响氨基磁珠和基因组dna结合的主要因素，当ph等于或大于10时，电泳条带非常暗，表明只有少量dna结合到氨基磁珠上。出现这种结果的原因可能是由于当溶液中的ph比氨基磁珠的等电点(9.6)高时氨基磁珠表面带有负电荷，不能吸引dna与其结合，故在ph等于或大于10时只能出现微弱的电泳条带。当溶液的ph比氨基磁珠的等电点低时，氨基磁珠带正电与带负电荷的dna结合紧密。从图中可以看出，当ph越接近等电点时条带越亮，故ph为9是最佳的tebuffer的ph值。

2.2蛋白酶k添加量的确定

本试验基于1.2.2所述的方法，针对其中蛋白酶k的添加量进行了梯度优化，6组试验的蛋白酶k添加量分别为0μl，10μl，20μl，30μl，40μl，50μl，再分别对捕获后的dna进行扩增和琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2所示，当蛋白酶k的添加量为30μl时，电泳条带是最亮的。当添加量小于30μl时，基质中的蛋白质去除的不充分，故会在一定程度上抑制pcr。当蛋白酶k添加量大于30μl时，容易造成蛋白酶k降解不彻底，由于蛋白酶k本身也是一种蛋白质，同样会抑制pcr的效果，故30μl选为最佳蛋白酶k的添加量。

2.3捕获孵育时间的确定

本试验基于1.2.2所述的方法，针对其中捕获孵育时间进行了梯度优化，7组试验的捕获孵育时间分别为15min，30min，1h，2h，3h，4h，5h，再分别对捕获后的dna进行扩增和琼脂糖凝胶电泳。

结果如图3所示，在15min，30min和1h的捕获时间里，电泳条带清晰明亮，在大于1h的捕获时间里条带呈现随着时间增加逐渐变暗的变化，产生这一现象的可能原因是过长的时间导致氨基磁珠发生了氧化反应。为减少检测时间，同时考虑奶粉基质的复杂性，最终选择30min为最佳捕获时间。

2.4捕获孵育温度的确定

本试验基于1.2.2所述的方法，针对其中捕获孵育温度进行了梯度优化，5组试验的捕获孵育温度分别为40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，再分别对捕获后的dna进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。

结果如图4所示，在60℃的孵育温度下电泳条带最亮。在温度从40℃变化到60℃时，电泳条带明显逐渐变亮可能是由于更高的温度诱发了更多的双链dna打开，另一个可能的原因是由于高温促进了氨基磁珠和dna分子的运动，使磁珠和dna分子更容易碰撞结合。而当温度大于60℃，电泳条带有了明显的变暗，这是由于氨基磁珠在高温条件发生了氧化，造成了部分磁性的损失。因此最终选择了60℃为最佳孵育温度。

2.5mgso4浓度的确定

本试验基于1.2.4所述的方法，针对其中mgso4浓度进行了梯度优化，8组试验的mgso4浓度分别为50mm，100mm，150mm，250mm，300mm，350mm，400mm，500mm，再通过阴性和阳性对照组的颜色对比判断最佳浓度。结果如图5所示，mgso4浓度为50mm-150mm时，阳性管和阴性管均呈现红色，产生了假阳性结果；在mgso4浓度为150mm-250mm以及350mm-400mm时，阴性管呈现蓝色，阳性管呈现红色，但两管的颜色对比程度不够明显易见；在mgso4浓度为500mm时，阴性管和阳性管均呈现蓝紫色，产生了假阴性结果；而在mgso4浓度为300mm时，阳性管呈现了鲜明的红色而阴性管呈现了对比明显的紫蓝色，故最终选取300mm为mgso4的最佳浓度。

2.6胶体金探针溶液与pcr产物体积比的确定

本试验基于1.2.4所述的方法，针对其中胶体金探针溶液与pcr产物体积比(共10μl)进行了梯度优化，9组试验的体积比分别为9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9，再通过阴性和阳性对照组的颜色对比判断最佳浓度。结果如图6所示，体积比在6:4-9:1时阳性管的红色呈现逐渐变浅的趋势，而阴性管的蓝色也越来越浅，并向红色逐渐靠近，两管颜色对比不够明显；体积比在4:6-1:9时，阳性管的红色逐渐加深，最终呈现紫色的假阴性状态；而在在胶体金探针溶液与pcr产物体积比为5:5时，阳性管的红色和阴性管的紫蓝色对比最为明显，故最终选取5:5为最佳胶体金探针溶液与pcr产物体积比。

2.7磁捕dna结合胶体金比色法检测阪崎克罗诺杆菌的灵敏度

从图6可见，阪崎克罗诺杆菌纯培养物浓度为10⁷cfu/ml-10¹cfu/ml时，最终的检测结果呈现阳性的粉红色，而在纯培养物浓度达到10⁰cfu/ml时。最终的检测结果开始显现蓝紫色，本实验建立的磁捕dna结合胶体金比色法对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检出限为3.5×10¹cfu/ml。

2.8磁捕dna结合胶体金比色法检测人工污染奶粉中阪崎克罗诺杆菌

从图7可见，人工污染奶粉中阪崎克罗诺杆菌的浓度为10⁷cfu/ml-10²cfu/ml时最终溶液呈现红色，而当菌液浓度达到3.5×10¹cfu/ml时溶液开始呈现蓝紫色，本实验建立的磁捕dna结合胶体金比色法对人工污染奶粉中阪崎克罗诺杆菌的检出限为3.5×10²cfu/ml。结果表明此方法虽然可以有效的减少乳中基质对pcr的影响，但还是不能完全解除脂肪蛋白质等对pcr的抑制作用，但是此方法大大减少了检测时间，替代了传统方法中过长的前增菌时间，对乳制品中致病菌的快速检测发展有很大的意义。

2.9磁捕dna结合胶体金比色法检测阪崎克罗诺杆菌的特异性

本实施例在抗体的特异性评价上，主要选取了克罗诺杆菌亲缘关系较近的菌，即产气肠杆菌atcc13048、阴沟肠杆菌atcc13047、大肠杆菌cmccb4413、单增李斯特菌cmcc54006，同时选取了三株atcc保藏的克罗诺杆菌。从图8可见，三株阪崎克罗诺杆菌的离心管均呈现粉红色。其他4株非阪崎克罗诺杆菌均呈阴性反应结果，离心管颜色呈现蓝紫色，表明此方法特异性良好。

3结论

阪崎克罗诺杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎，小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达百分之五十以上，因此对于阪崎克罗诺杆菌的预防和检测是非常重要的。传统的检测方法需要较长的前增菌时间，操作繁琐。常用的免疫磁分离技术虽然缩短了检测时间，但是抗体制备困难，成本高等问题同样限制了快检技术的发展。而目前比较受欢迎的分子生物学检测技术大多数需要用琼脂糖凝胶电泳观测检测结果，该方法需要大型仪器，耗时长，同时需要使用易制毒试剂等。本实验利用氨基磁珠对核酸的捕获特性和胶体金比色法的显色特性，可以大大缩短检测时间，并可以在10分钟内完成对检测结果的肉眼直接观测，实现对于阪崎克罗诺杆菌的简单、快速的检测。

本发明对于磁珠捕获核酸过程中的tebuffer的ph值，蛋白酶k的添加量，捕获孵育时间，捕获孵育温度进行了优化，确定tebuffer的ph值为9，蛋白酶k的添加量为30μl，捕获孵育时间为30min，捕获孵育温度为60℃。同时本实验也优化了胶体金比色法过程中的mgso4的浓度以及胶体金探针和pcr产物的体积比，确定mgso4的浓度为300mm,胶体金探针和pcr产物的体积比5:5。本实验检测灵敏度可达10¹cfu/ml，并且与产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌无交叉反应。对于人工污染乳中的阪崎克罗诺杆菌的检测，可达到10²cfu/ml，为乳中阪崎克罗诺杆菌的检测提供了一种高效、高特异性的方法。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>东北农业大学

<120>一种基于磁捕获的纳米金比色法快速检测阪崎克罗诺杆菌的方法

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