本发明属于生物法制备手性化合物，涉及一种应用南极假丝酵母脂肪酶a立体选择性催化水解2,3-二苯基丙酸酯对映体合成单一构型的2,3-二苯基丙酸对映体的方法。将南极假丝酵母脂肪酶a用于水解（1）所示结构的外消旋2,3-二苯基丙酸酯合成单一构型的（2）。
（1）（2）
背景技术：
2,3-二苯基丙酸(2,3-diphenylpropionicacid,2,3-2-ppa)，又名β-苯基苯丙酸,因其是合成具有有效的vla-4拮抗活性的中间体，并且由于其非肽基结构而导致更好的口服生物利用度和代谢稳定性。因其可能具有的对整合素家族的vla-4(非常晚出现抗原一4)的较强的拮抗活性,拮抗vla-4的小分子可用于治疗慢性炎性疾病如哮喘，多发性硬化和类风湿性关节炎。考虑到药理活性以及毒副作用，单一对映体的制得非常重要。目前，已报道的对2,3-2-ppa手性拆分的方法有色谱法，萃取法。
单一手性药物对映体的获得方法主要有化学合成法和外消旋体拆分法。化学合成法易产生大量无效甚至对环境有害的对映体造成环境污染。到目前为止，工业应用中占主导地位的手性制备工艺仍然是外消旋体拆分法。它的工艺简单、易于工业化生产、成本较低、开发时间较短。常见的外消旋拆分技术包括结晶法、色谱法、膜法、酶或微生物法、萃取法等。其中手性溶剂萃取法因为容易实现连续生产、容易工业放大、操作简单、生产成本低、适用范围广等，正受到越来越多的关注，被认为是最具发展潜力和应用前景的手性拆分技术之一。目前困扰手性溶剂萃取法大规模工业应用的关键问题是手性萃取剂选择性不够高、产率低。而酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性,催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题,对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。
本发明中公开了一种利用南极假丝酵母脂肪酶a立体选择性催化水解2,3-二苯基丙酸酯对映体合成单一构型的2,3-二苯基丙酸的方法，本发明利用南极假丝酵母脂肪酶a对2,3-二苯基丙酸酯对映体的高选择性、高催化效率，利用绿色添加剂环糊精提高2,3-二苯基丙酸酯对映体的溶解度，从而加速2,3-二苯基丙酸酯对映体在缓冲溶液中水解，催化效率高，产物光学纯度高。该技术解决了一般拆分技术所存在的低光学纯度和产率低的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高效获得单一构型2,3-二苯基丙酸对映体的新技术。
本发明针对于一般外消旋体拆分法分离手性对映体的产物光学纯度及其产率不高等难题，提出了一种获得单一构型2,3-二苯基丙酸的方法—利用南极假丝酵母脂肪酶a对2,3-二苯基丙酸酯对映体的高选择性、高催化效率合成单一对映体2,3-二苯基丙酸的方法。
本发明的技术方案：首先将一定浓度的磷酸盐缓冲溶液作为反应体系，向磷酸盐缓冲溶液中加入一定量的环糊精；用磷酸调节溶液ph为3.0-7.0；将一定浓度的2,3-二苯基丙酸酯对映体和南极假丝酵母脂肪酶a加入到上述溶液中，2,3-二苯基丙酸酯对映体的浓度为30-120mmol，南极假丝酵母脂肪酶a的浓度为5-50mg/ml，环糊精浓度为5-100mmol/l；于25ml的反应管中在一定转速下加热反应一定时间并对反应进行监测。并通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测;测得产物的光学纯度>98.24%，底物转化率可达44.79%，立体选择性e>270。
其中，
2,3-二苯基丙酸酯是选自2,3-二苯基丙酸甲酯、2,3-二苯基丙酸乙酯、2,3-二苯基丙酸丙酯、2,3-二苯基丙酸异丙酯、2,3-二苯基丙酸丁酯、2,3-二苯基丙酸异戊酯、2,3-二苯基丙酸己酯；
磷酸盐选自磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾中的一种或几种；
环糊精选自羟乙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，甲基化-β-环糊精，羧甲基-β-环糊精，磺丁基-β-环糊精中的其中一种；
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用南极假丝酵母脂肪酶a对2,3-二苯基丙酸酯对映体的高立体选择性、高催化效率以及环糊精对2,3-二苯基丙酸酯在水中的增溶作用，强化2,3-二苯基丙酸酯对映体在磷酸盐缓冲溶液中水解反应，且该方法反应条件温和、绿色环保、生物酶可重复利用；本发明采用南极假丝酵母脂肪酶a对2,3-二苯基丙酸酯对映体进行拆分，通过控制反应温度、磷酸盐缓冲溶液ph值、酶浓度、环糊精浓度等条件，可提高单一构型的2,3-二苯基丙酸对映体的纯度和产率。本方法实施方法简单，操作简便。
【具体实施方式】
下面结合本发明的实施例对本发明做进一步说明：
一、测试与分析
本发明所述实施例中分离产物的对映体过剩量和底物转化率采用waterse2695高效液相色谱仪分析以及sunfiretmods-3色谱柱（150mm×4.6mm,5μm）。
二、实施例
实施例1
将40mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和10mg的几种商品化脂肪酶（皱褶假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶a、荧光假单孢菌脂肪酶、洋葱假单孢菌脂肪酶、米曲霉、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶b、米黑根毛霉、猪胰脂肪酶、雪白根酶）分别加入到1mlph为6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在400rpm、40℃下加热反应16h；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析。分析得：南极假丝酵母脂肪酶a作为催化剂时底物转化率为6.30%,产物的光学纯度为94.18%。
实施例2
将40mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和20mg的南极假丝酵母脂肪酶a加入到1mlph为6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在400rpm、反应温度为60℃,加热反应4h；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析；此时，底物转化率为20.35%,产物的光学纯度为95.70%。
实施例3
将40mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和10mg的南极假丝酵母脂肪酶a加入到1mlph为5.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在400rpm、60℃下加热反应24h；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析；此时，底物转化率为35.75%,产物的光学纯度为95.44%。
实施例4
将60mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和30mg的南极假丝酵母脂肪酶a加入到1mlph为5.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在400rpm、60℃下加热反应24h时间；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析；此时，底物转化率为42.93%,产物的光学纯度为95.28%。
实施例5
将120mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和30mg的南极假丝酵母脂肪酶a加入到1mlph为5.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中(缓冲溶液中含有25mmol/l的羟丙基-β-环糊精）；于25ml的反应管中在400rpm、60℃下加热反应26h；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析;此时，底物转化率为37.05%,产物的光学纯度为97.10%。
实施例6
将120mmol的2,3-二苯基丙酸甲酯对映体和30mg的南极假丝酵母脂肪酶a加入到1ml含有25mmol/l的羟丙基-β-环糊精ph=5.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在400rpm、60℃下加热反应；对反应进度进行监测；并对反应进度和产物的光学纯度进行高效液相色谱分析。分析得：当反应进行40h时底物转化率为44.79%,产物的光学纯度为98.24%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。