本发明涉及手性化合物合成
技术领域：
，具体而言，涉及一种制备具有多个手性中心的胺化合物的方法。
背景技术：
：手性胺广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体，很多手性胺还是很有用的手性助剂和手性拆分试剂。许多手性胺都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。含多个手性中心的手性胺因其独特的生理活性，在医药研发上有着广泛的应用价值和广阔的应用前景而被人们深入的研究。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。现阶段，制备手性胺的方法主要常采用化学还原的方法从前手性酮制备得到光学活性的胺。在pd/c及喹宁的催化作用下，于有机溶剂中，前手性酮与甲酸以及无机氨/有机伯胺反应；另有研究者以钌配合物为催化剂，通过前手性酮不对称胺化还原得到手性胺(angewandtechemie，internationaledition,2003,42(44),5472-5474)，此类反应中金属催化剂是非常关键而重要的因素(angew,chem.,int.ed.2001,40,40.)，且对金属催化剂要求苛刻，反应需要在高压条件完成，操作设备要求高，同时金属催化剂价格昂贵，对环境污染也较大(j.am.chem.soc.2002,124,6508.)。尽管如此，通过一步反应仅能获得含一个手性中心的手性胺化合物。而含有多个连续手性中心的结构单元常见于各种天然产物和人工合成的手性药物中，但由于异构体的数量随着手性中心的数目成指数上升，由此导致高选择性的合成多个手性中心的单一异构体非常困难，一直以来是不对称催化研究领域最具挑战性的课题之一。由此可见，通过化学法生产手性胺存在下列问题：1)通常需要手性金属催化剂，生产成本高；2)产物的光学纯度较难达到要求；3)大量使用有机试剂，造成环境污染严重；4)不能一步获得两个几多个手性中心的产品。技术实现要素：本发明旨在提供一种制备具有多个手性中心的胺化合物的方法，以解决现有技术中采用化学法生产不能一步获得具有两个及多个手性中心产品的技术问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种制备具有多个手性中心的胺化合物的方法。该方法包括以下步骤：在转氨酶的作用下与氨基供体在反应体系中反应生成其中，r1、r2分别为甲基或乙基，r3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n＝0或1。进一步地，转氨酶的氨基酸序列为选自如下之一的序列：1)如seqidno：1所示的氨基酸序列；2)如seqidno：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有高度立体选择性将转化成的转氨酶活性的氨基酸序列。进一步地，氨基供体为异丙胺、d-丙氨酸、α-苯乙胺、苄胺或l-丙氨酸。进一步地，反应体系中还包括磷酸吡哆醛、氨基供体所对应的去抑制循环体系和缓冲液。进一步地，反应体系中的摩尔浓度为50mm～500mm，氨基供体为的1.1～4eq；磷酸吡哆醛的加入量为的0.1％～3％w/w。进一步地，去抑制循环体系包括d-乳酸脱氢酶、d-葡萄糖、辅酶nad+和葡萄糖脱氢酶gdh。进一步地，反应体系中还包括促溶剂。进一步地，促溶剂的加入量为反应体系体积的1％～15％v/v。进一步地，促溶剂为聚乙二醇peg-400、二甲基亚砜、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。进一步地，缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-cl缓冲液或三乙醇胺缓冲液。进一步地，反应体系的ph值为7.0～8.5，反应体系的反应温度为20℃～45℃。应用本发明的技术方案，转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，并可以选择性的拆分，一步获得具有多个手性中心的手性胺化合物；而且底物相对廉价，产物纯度高的特点，适合推广用于手性胺的工业生产。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。针对
背景技术：
中提到的具有多个手性中心化合物的生产方法存在的一系列问题，本发明提出下列技术方案。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种制备具有多个手性中心的胺化合物的方法。该方法包括以下步骤：在转氨酶的作用下与氨基供体在反应体系中反应生成其中，r1、r2分别为甲基或乙基，r3为叔丁氧羰基或者苄氧羰基，n＝0或1，优选的，转氨酶的氨基酸序列为选自如下之一的序列：1)如seqidno：1所示的氨基酸序列；2)如seqidno：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有高度立体选择性将转化成的转氨酶活性的氨基酸序列。其中，高度立体选择性在本发明中是本领域通用的含义，优选e.e值≥90％,de值≥90％。上述原料为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，可以满足规模化生产的需要。应用本发明的技术方案，转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，并可以选择性的拆分，一步获得具有多个手性中心(本发明中的“多个”包括两个及两个以上)的手性胺化合物；而且底物相对廉价，产物纯度高的特点，适合推广用于手性胺的工业生产。优选的，氨基供体为异丙胺、d-丙氨酸、α-苯乙胺、苄胺或l-丙氨酸。这些氨基供体具有易得，经济适用，并且有利于本发明的反应进行等优点。为了使上述反应更加顺利的进行，反应体系中还包括磷酸吡哆醛、氨基供体所对应的去抑制循环体系和缓冲液。其中，磷酸吡哆醛作为转氨酶的辅因子；缓冲液使反应体系能够具备良好的ph值。优选的，缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-cl缓冲液或三乙醇胺缓冲液；促溶剂为聚乙二醇peg-400、二甲基亚砜、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。反应体系的ph值为7.0～8.5，反应体系的反应温度为20℃～45℃。根据本发明一种典型的实施方式，d-乳酸脱氢酶、d-葡萄糖、辅酶nad+和葡萄糖脱氢酶gdh组成去抑制循环体系。其中，d-乳酸脱氢酶和nadh将氨基供体为d-丙氨酸时产生的丙酮酸生成乳酸，而还原态的nadh因为其价格昂贵，常使用辅酶再生体系如：nad+、葡萄糖脱氢酶、d-葡萄糖来生成nadh。有些反应物溶解性不是很好，促溶剂的作用能够使溶解性不好的反应物溶解，以方便反应的进行。在生产过程中，可以根据实际情况添加促溶剂，优选的，促溶剂的加入量为反应体系体积的1％～15％v/v。促溶剂可以为聚乙二醇peg-400、二甲基亚砜、水、乙腈、甲醇或甲基叔丁基醚。根据本发明一种典型的实施方式，反应体系中的摩尔浓度为50mm～500mm，氨基供体为的1.1～4eq；磷酸吡哆醛的加入量为的0.1％～3％w/w。根据本发明一种典型的实施方式，反应完成后进一步包括：将反应体系ph值调节至10以上，用有机溶剂萃取两次，得到的有机相经干燥、过滤、浓缩后得到粗品化合物。优选的，反应体系ph值用2nnaoh调节至10以上。根据本发明一种典型的实施方式，进一步包括：对得到的粗品化合物进行gc和hplc检测。下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。实施例110ml的反应瓶中，将0.11g(1.86mmol)异丙胺加入5ml0.2m磷酸盐缓冲液中，调ph为7.0～7.5，加入转氨酶0.1g(冻干粉制剂)、0.003g磷酸吡哆醛，混匀后滴入溶于0.5mldmso的0.1g主原料体系ph为7.0～7.5，25℃±3℃恒温搅拌20h。体系用2nnaoh调节ph至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品其中转氨酶筛选了100种(此100种转氨酶均是来自文献报道的已知序列人工合成或上述序列经过人工突变得到)，体系经gc检测转化率，hplc检测手性，绝大多数的转氨酶的反应体系中剩余大量原料，没有产品生成。有产品生成的反应结果如表1所示，选择性最好的为ata，可见并非所有转氨酶均适用于本发明中的含两个手性中心的手性胺制备。部分数据如下：表1.转氨酶的来源及反应结果酶来源转化率e.e值de值ata(seqidno：1)actinobacteria46.3％99.70％96.68％atta(seqidno：2)aspergillusterreus27.2％97.38％76.45％pata(seqidno：3)pseudomonasaeruginosa6.58％96.41％78.06％bsaat(seqidno：4)burkholderiasp32.7％49.49％ndoata(seqidno：5)ochrobactrumanthropic15％-84.10％-10.20％btta(seqidno：6)burkholderiathailandensis17.9％13.23％nd实施例2(1)投料：向25ml反应瓶中，加入0.1g主原料100ul聚乙二醇peg-400，3ml磷酸盐缓冲液(100mm，ph＝8.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；(2)加转氨酶：向25ml反应瓶中，加入600ul1m异丙胺盐酸盐，0.5mg磷酸吡哆醛，0.05g转氨酶ata(冻干粉制剂)，体系ph＝8.0；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应24h；(4)后处理：体系用2nnaoh调节ph至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品经过gc和hplc检测，转化率47.6％，e.e值97.34％，de值99.7％。实施例3向10ml的反应瓶中加入，0.1g主原料2.5mltris-cl缓冲液(100mmol/l，ph＝8.5)，原料分散后，加入0.1gd-丙氨酸，0.22gd-葡萄糖，0.01g的辅酶nad+，和0.005g葡萄糖脱氢酶gdh，1mg磷酸吡哆醛，充分溶解后，加入0.1g转氨酶ata(冻干粉制剂),体系ph为8.5，40℃±3℃恒温搅拌20h。体系用2nnaoh调节ph至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品经过gc和hplc检测，转化率43.5％，e.e值98.9％，de值99.2％。实施例4(1)投料：向25ml反应瓶中，加入0.1g主原料100ul聚乙二醇peg-400，3ml磷酸盐缓冲液(100mm，ph＝8.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；(2)加转氨酶：向25ml反应瓶中，加入600ul1m异丙胺盐酸盐，0.5mg磷酸吡哆醛，0.1g转氨酶ata-v31y(seqidno：131位v突变为y，seqidno：7，冻干粉制剂)，体系ph＝8.0；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应24h；(4)后处理：体系用2nnaoh调节ph至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品经过gc和hplc检测，转化率46.8％，e.e值98.27％，de值98.9％。实施例5(1)投料：向25ml反应瓶中，加入0.1g主原料0.5ml聚乙二醇peg-400，3ml磷酸盐缓冲液(100mm，ph＝8.0)，原料均匀分散于磷酸盐缓冲液中；(2)加转氨酶：向25ml反应瓶中，加入1ml1m异丙胺盐酸盐，0.5mg磷酸吡哆醛，0.1g转氨酶ata-l105m(seqidno：1105位l突变为m，seqidno：8，冻干粉制剂)，体系ph＝8.0；(3)反应：体系于30℃反应，搅拌反应24h；(4)后处理：体系用2nnaoh调节ph至10以上，用乙酸乙酯萃取两次，有机相经干燥，过滤，浓缩得到粗品经过gc和hplc检测，转化率45.3％，e.e值98.34％，de值99.25％。从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：1)避免了化学合成法中手性金属催化剂的使用，并且原料为商业化的原料或者易制备的原料且价格低廉，极大的降低了生产成本；2)产物的光学纯度高；3)避免了大量使用有机试剂，环境友好；4)一步获得具有多个手性中心的手性胺化合物。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>凯莱英生命科学技术（天津）有限公司<120>制备具有多个手性中心的胺化合物的方法<130>pn74324kly<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>341<212>prt<213>actinobacteria<400>1metthrileserlysaspileasptyrserthrserasnleuvalser151015valalaproglyalailearggluprothrproalaglyservalile202530glntyrserasptyrgluleuaspgluserserprophealaglygly354045alaalatrpilegluglyglutyrvalproalaalaglualaargile505560serleupheaspthrglypheglyhisseraspleuthrtyrthrval65707580alahisvaltrphisglyasnilepheargleulysasphisileasp859095argvalpheaspglyalaglnlysleuargleuglnserproleuthr100105110lysalagluvalgluaspilethrlysargcysvalserleusergln115120125leuarggluserphevalasnilethrilethrargglytyrglyala130135140arglysglyglulysaspleuserlysleuthrserglniletyrile145150155160tyralaileprotyrleutrpalapheproproglugluglnilephe165170175glythrseralailevalproarghisvalargargalaglyargasn180185190thrvalaspprothrvallysasntyrglntrpglyaspleuthrala195200205alaserpheglualalysaspargglyalaargthralaileleuleu210215220aspalaaspasncysvalalagluglyproglypheasnvalvalmet225230235240vallysaspglylysleuserserproserargasnalaleuprogly245250255ilethrargleuthrvalmetglumetalaaspglumetglyileglu260265270phethrleuargaspilethrserarggluleutyrglualaaspglu275280285leuilealavalthrthralaglyglyilethrproilethrserleu290295300aspglygluproleuglyaspglythrproglyprovalthrvalala305310315320ileargaspargphetrpalametmetaspgluproserserleuval325330335glualaileglutyr340<210>2<211>327<212>prt<213>aspergillusterreus<400>2metalasermetasplysvalphealaglytyralaalaargglnala151015ileleugluserthrgluthrthrasnprophealalysglyileala202530trpvalgluglygluleuvalproleualaglualaargileproleu354045leuaspglnglyphemethisseraspleuthrtyraspvalproser505560valtrpaspglyargphepheargleuaspasphisilethrargleu65707580glual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