本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法。
背景技术：
三磷酸腺苷是一种多功能的核苷酸，不仅是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，也是细胞外的信号传递者，参与多种生物过程，例如膜离子通道泵、dna复制、生物合成、激素和神经活性等。atp可作为细胞活性的一个标志物，具有代谢活性的细胞含有一定量的atp，检测atp含量可作为培养细胞增殖和细胞毒性的定量指标，而在细胞发生凋亡或坏死时，其atp含量会迅速下降。通过监测atp含量的改变，也可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。atp也常作为微生物污染的一个指标，微生物繁殖引起食品、药品等atp含量的增高，因此对atp进行高灵敏高选择性的检测对生物化学研究和临床诊断领域至关重要。
atp的检测方法包括层析法、电泳法、光学分析法等，虽然这些方法可以实现atp的检测，但是检测灵敏度低，很难达到高灵敏的检测需求，因此只有开发高灵敏的atp检测方法才能实现atp的检测需求。随着纳米科学技术的不断发展，纳米材料组装体及其性质的研究得到不断创新，纳米材料组装体的光学性质和应用是当今纳米技术发展的重大方向，尤其是贵金属纳米粒子的可控组装及其新型光学特性的研究，是纳米科学领域研究的一个非常活跃的热点问题，利用纳米材料组装体的光学特性在生物传感领域的应用具有重大的优越性，如拉曼传感器、荧光传感器、比色传感器等。近年来，由等离子纳米粒子组装成的手性纳米结构表现出的圆二色谱信号引起研究者广泛的研究兴趣，这一发现对纳米材料在检测领域的应用成为一个新的进展，可以应用手性纳米材料组装体的cd信号作为检测信号对目标物进行检测。
技术实现要素：
要解决的技术问题：现有的atp检测方法检测灵敏度低，难以达到高灵敏的检测需求。
技术方案：本发明公开了一种手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法，包括如下步骤：
（1）不同粒径的金纳米粒子的合成
通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行金纳米粒子的合成，并通过改变柠檬酸三钠的添加量控制金纳米粒子的粒径大小。
（2）金纳米粒子修饰dna分子
将步骤（1）合成的大粒径的金纳米粒子在7000r/min的条件下离心去除上清，小粒径的金纳米粒子在9000r/min的条件下离心去除上清，均用ph7.2的0.01mpbs缓冲液进行重悬并浓缩5倍，再用pbs缓冲液将两种纳米粒子的浓度稀释到20nm，将dna1加入到大粒径金纳米粒子中，dna2加入到小粒径金纳米粒子中，使得两种dna的终浓度均为40nm，置于室温条件下孵育4~8h后，分别在7000r/min和9000r/min的条件下离心去除上清，并用ph7.6的0.05mtris-hcl缓冲液将金纳米粒子进行重悬，得到dna修饰的两种金纳米粒子；
dna1：5’-sh-gcctaacgcttacg-3’；
dna2：5’-atggcatggcattc-sh-3’。
（3）金纳米粒子二聚体的形成以及atp的检测
将步骤（2）制备的dna修饰的两种金纳米粒子等体积混合，然后加入dna3使得其终浓度为30nm，混合均匀后，分装到250μl的离心管中，每管100μl，向各管中均加入终浓度为5u的t4dna连接酶，再分别加入5μl不同浓度的atp分子，添加浓度为0nm、0.1nm、0.2nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm，在室温下反应0.5~2h后，在每管中加入终浓度为10~30u的核酸外切酶ⅲ，继续孵育50min，然后置于80℃孵育5min终止反应，用圆二色光谱仪测定每管的手性信号强度；
dna3：5’-caagtgaatgccatgccatcgtaagcgttaggcaggct-3’。
本发明所述的手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法中两种粒径的金纳米粒子的合成方法为：分别取95ml超纯水加入到两个250ml干净的锥形瓶中，再向两个锥形瓶中加入2.5ml质量浓度为0.4%的氯金酸溶液，将其置于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，持续沸腾10min后，分别加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液2.5ml（12nm金纳米粒子）和2ml（20nm金纳米粒子），继续加热搅拌，溶液从无色变为酒红色，停止加热，继续搅拌至溶液冷却至室温，即得粒径为20nm金纳米粒子和12nm金纳米粒子。
本发明所述的手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法中dna1和dna2与金纳米粒子的孵育时间为6h。
本发明所述的手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法步骤（3）中atp与金纳米粒子的反应时间为1h。
本发明所述的手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法中核酸外切酶ⅲ添加的终浓度为20u。
有益效果：本发明将与模板dna互补的两段dna分子分别修饰在不同粒径的金纳米粒子表面，其中两段dna分子与模板dna的中间部位互补，杂交后的模板dna分子为两端单链凸出中间双链杂交的结构，通过控制金纳米粒子表面dna的修饰量，dna修饰的金纳米粒子与模板dna分子互补杂交后，形成中间含有切口两端凸出单链dna的部分杂交双链dna结构，同时金纳米粒子则形成二聚体结构，在atp存在的作用下，t4dna连接酶将两段dna的切口连接成一条完整的dna链，其上的金纳米粒子则形成稳定的二聚体结构，未进行连接的切口则在核酸外切酶ⅲ的作用下将dna1从3’-5’端进行酶切，从而使得金纳米粒子二聚体不能形成，atp的浓度不同，形成的稳定的金纳米粒子二聚体的含量不同，则二聚体的手性信号产生差异，根据atp的浓度和手性信号的对应关系，可以实现atp的检测。
附图说明
图1金纳米粒子二聚体的tem图。
图2atp添加前后的圆二色光谱图。
图3atp检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种手性金纳米粒子二聚体检测atp的方法，包括如下步骤：
（1）不同粒径的金纳米粒子的合成
分别取95ml超纯水加入到两个250ml干净的锥形瓶中，再向两个锥形瓶中加入2.5ml质量浓度为0.4%的氯金酸溶液，将其置于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，持续沸腾10min后，分别加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液2.5ml（12nm金纳米粒子）和2ml（20nm金纳米粒子），继续加热搅拌，溶液从无色变为酒红色，停止加热，继续搅拌至溶液冷却至室温，即得粒径为20nm金纳米粒子和12nm金纳米粒子。
（2）金纳米粒子修饰dna分子
将步骤（1）合成的20nm金纳米粒子在7000r/min的条件下离心去除上清，12nm金纳米粒子在9000r/min的条件下离心去除上清，均用ph7.2的0.01mpbs缓冲液进行重悬并浓缩5倍，再用pbs缓冲液将两种纳米粒子的浓度稀释到20nm，将dna1加入到20nm金纳米粒子中，dna2加入到12nm金纳米粒子中，使得两种dna的终浓度均为40nm，置于室温条件下孵育6h后，分别在7000r/min和9000r/min的条件下离心去除上清，并用ph7.6的0.05mtris-hcl缓冲液将金纳米粒子进行重悬，得到dna修饰的两种金纳米粒子；
dna1：5’-sh-gcctaacgcttacg-3’；
dna2：5’-atggcatggcattc-sh-3’。
（3）金纳米粒子二聚体的形成以及atp的灵敏度分析
将步骤（2）制备的dna修饰的两种金纳米粒子等体积混合，然后加入dna3使得其终浓度为30nm，混合均匀后，分装到250μl的离心管中，每管100μl，向各管中均加入终浓度为5u的t4dna连接酶，再分别加入5μl不同浓度的atp分子，添加浓度为0nm、0.1nm、0.2nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm，在室温下反应1h后，在每管中加入终浓度为20u的核酸外切酶ⅲ，继续孵育50min，然后置于80℃孵育5min终止反应，用圆二色光谱仪测定每管的手性信号强度；
dna3：5’-caagtgaatgccatgccatcgtaagcgttaggcaggct-3’。
根据atp的浓度和手性信号强度的对应关系得出，在0.1~5nm的浓度范围内，两者之间的线性关系良好，并通过计算得出atp的检测限为0.046nm。
（4）特异性分析
用此方法分别测定浓度为1nm的atp、gtp、ctp、ttp、utp五种物质，并添加一个空白对照，通过测定反应后的手性信号分析得出，gtp、ctp、ttp、utp的检测条件下的手性信号强度与未添加任何物质的空白对照相同，即均没有测得明显的手性信号，而atp检测条件下的手性信号强度明显比其它检测体检下的信号强度强，从而说明此方法不同实现其它三磷酸核苷的检测，而对atp检测的特异性良好。
（5）实际样本检测
将阴性人血清样本进行倍修饰，添加浓度为0.2nm、0.8nm、1.5nm、2.3nm、4.6nm的atp，用此方法测定在血清样本中atp的添加回收结果，通过检测结果得出，atp的添加回收率在97.2~99.3%之间，添加回收结果良好，可以实现实际样本的检测。