一种二氯乙酸修饰的蒽环类化合物与其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种抗肿瘤药物领域，更具体地，涉及一种二氯乙酸修饰的蒽环类化合物及其纳米粒的制备方法和应用。

背景技术：

蒽环类抗肿瘤药物包括阿霉素、柔红霉素、去甲柔红霉素和表柔比星等，并广泛应用于各种实体瘤和白血病的治疗，但其显著的副作用极大的限制其临床应用。蒽环类抗肿瘤药物可以引起剂量依赖性的心脏功能退化，包括心肌病和心力衰竭。同时也会引起其它非靶器官的毒性，如肝脏、大脑、脊髓等。纳米药物可以降低体内药物的毒性同时提高治疗效果，但同时大部分纳米药物都存在载药量低(<10％)，赋型剂降解和代谢难等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前肿瘤治疗中剂量依赖性的心脏功能退化的缺陷和非靶器官的毒性，以及纳米药物都存在载药量低和赋型剂降解和代谢难的技术问题。

本发明提供了一种二氯乙酸修饰的蒽环类化合物，该化合物中二氯乙酸和蒽环类物质通过酰胺键连接，具有如式ⅰ所示的结构通式：

其中r1为h或oh；r2为h或oh；r3为h或och3；r4为h或oh。

优选地，当r1＝h，r2＝oh，r3＝och3以及r4＝h，所述化合物为二氯乙酸修饰的柔红霉素；

优选地，当r1＝h，r2＝oh，r3＝och3以及r4＝oh，所述化合物为二氯乙酸修饰的阿霉素；

优选地，当r1＝oh，r2＝h，r3＝och3以及r4＝oh，所述化合物为二氯乙酸修饰的表阿霉素；

优选地，当r1＝h，r2＝oh，r3＝h以及r4＝h，所述化合物为二氯乙酸修饰的伊达比星。

按照本发明的另一方面，提供了所述的化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蒽环类药物与二氯乙酸酐溶于有机溶剂中，加入三乙胺；

(2)将步骤(1)所得溶液避光搅拌后，减压旋蒸除去溶剂得到粗产物；

(3)将步骤(2)所得粗产物用洗脱剂通过硅胶柱分离，减压旋蒸去除溶剂得到二氯乙酸修饰的蒽环类化合物。

优选地，所述蒽环类药物与二氯乙酸酐的物质的量比例为1：0.5～10；

优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或二甲亚砜；

优选地，步骤(1)中所述蒽环类药物与三乙胺的摩尔比为1：0.5～1：3；

优选地，步骤(2)中所述的搅拌时间为8h～48h；

优选地，步骤(3)中所述洗脱剂为卤代烃和醇类的混合物，其比例为1～100：1；

优选地，所述卤代烃为二氯甲烷和三氯甲烷中的至少一种，醇类为单元醇和多元醇中的至少一种。

按照本发明的另一方面，提供了所述的二氯乙酸修饰的蒽环类化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。

按照本发明的另一方面，提供了二氯乙酸修饰的蒽环类化合物纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将二氯乙酸修饰的蒽环类化合物和载体混合后溶于有机溶剂中，搅拌混匀后滴加至去离子水中；

(2)将步骤(1)中所得溶液透析除去有机溶剂二甲亚砜，即可得到纳米粒。

优选地，步骤(1)中二氯乙酸修饰的蒽环类化合物和载体的质量比为1：0.1～1：3；

优选地，步骤(1)中所述的载体为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯；

优选地，步骤(1)中所述的有机溶剂为二甲亚砜或乙醇。

按照本发明的另一方面，提供了二氯乙酸修饰的蒽环类化合物纳米粒，所述纳米粒由以上所述方法制备得到。

按照本发明的另一方面，提供了所述的二氯乙酸修饰的蒽环类化合物纳米粒在制备抗肿瘤药物上的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的二氯乙酸修饰的蒽环类化合物及其所形成的纳米粒中，二氯乙酸(dca)为小分子亲水性药物，与疏水性蒽环类药物偶联后可形成两亲性结构。在少量载体存在的条件下，该类抗肿瘤药物可以自组装形成纳米粒结构。该化合物及其纳米粒制剂具有以下优势：(1)纳米制剂的制备方法简单，重复性好，适合工业化生产；(2)该纳米制剂的载药量为71.8％，而目前绝大部分纳米制剂的载药量均小于10％。高的载药量可降低赋型剂的含量，因此大大减少赋型剂引起的降解难、体内副作用以及代谢和排泄困难等问题；(3)稳定性好，适合储存和运输；(4)该纳米制剂的体内最大耐受计量为75mgdoxequiv./kg，且未见明显的心、肝、脾、肺和肾脏的损伤，体内毒副作用低，安全性好，进而提高患者的依从性；(5)肿瘤局部富集高，靶向效率好；(6)肿瘤抑制率可以达83.0％，抗肿瘤效果良好。

附图说明

图1为阿霉素和阿霉素-二氯乙酸的¹hnmr谱图；

图2为阿霉素-二氯乙酸的质谱结果；

图3为阿霉素和阿霉素-二氯乙酸在高效液相色谱的保留时间；

图4为阿霉素、二氯乙酸和阿霉素-二氯乙酸的傅里叶变换红外光谱图；

图5为阿霉素-二氯乙酸纳米粒的透射电镜和动态光散射粒度仪分析结果；

图6为阿霉素-二氯乙酸纳米粒以及普通以dspe-peg2000为载体的阿霉素纳米粒的包封率和载药量；

图7为阿霉素-二氯乙酸纳米粒在常温下pbs中的粒径变化；

图8为降低dspe-peg2000含量时阿霉素-二氯乙酸纳米粒的包封率和载药量；

图9为阿霉素和阿霉素-二氯乙酸纳米粒的最大耐受剂量实验；

图10为最大耐受剂量实验后相应的血生化参数和病理学研究；

图11为荧光染料dir和dir标记的阿霉素-二氯乙酸纳米粒的在黑色素瘤b16f10荷瘤小鼠活体成像和离体组织分布结果；

图12为黑色素瘤b16f10荷瘤小鼠分别尾静脉注射pbs、阿霉素5mg/kg、阿霉素-二氯乙酸纳米粒5mg/kg和阿霉素-二氯乙酸纳米粒15mg/kg后肿瘤体积的变化(a)、肿瘤瘤体图像(b)、相对体重的变化(c)和肿瘤重量(d)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：阿霉素-二氯乙酸(dox-dca)的合成

具体合成步骤为：将盐酸阿霉素(50mg,0.086mmol)与二氯乙酸酐(19.7μl,0.129mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，加入17.5μl的三乙胺(0.129mmol)，以脱去蒽环类药物的盐酸盐，避光搅拌24h后，减压旋蒸除去溶剂，通过硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，其体积比为20：1，收集产物，旋蒸得到33.2mg的固体粉末。产率：59％。

利用¹h-nmr确证产物的化学结构，其图谱如图1所示，该产物具有阿霉素与二氯乙酸(6.4-6.6ppm)的特征峰。同时，阿霉素和二氯乙酸偶联后新生成的酰胺键(8.2-8.4ppm)也可以证明化合物的合成。

使用esi-ms高分辨质谱(负离子模式)分析产物的分子量，结果如图2所示。在负离子模式下，阿霉素-二氯乙酸[m-h]^-的理论分子量为652.1，与质谱图中m/z＝652.3的峰一致。

使用高效液相色谱鉴定并检测终产物的纯度，反相色谱柱为restek公司的viva-c18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相条件为梯度洗脱(0-10min，b25％-60％)，其中a为0.1％三氟乙酸水溶液，b为乙腈。荧光检测波长设定为470nm/585nm，流速为1ml/min。检测结果如图3所示，阿霉素-二氯乙酸的保留时间为9.4min，而阿霉素的保留时间为5.4min，说明这是两个不同的物质。通过峰面积积分法估算出产物的纯度为98.5％，产物纯度较高。

图4为二氯乙酸、阿霉素和阿霉素-二氯乙酸的特征红外吸收谱图。阿霉素和二氯乙酸偶联后所新生成的酰胺键在1687cm^-1处有振动峰。

实施例2：阿霉素-二氯乙酸的自组装纳米粒的制备及表征

纳米粒制备的具体操作步骤为：将1mg的阿霉素-二氯乙酸和0.3mg的dspe-peg2000(w/w,1/0.3)混合并溶于50μl的二甲亚砜中，在磁力搅拌下滴加至1ml的去离子水中。然后透析除去二甲亚砜，即可得到纳米粒。

通过透射电镜和动态光散射粒度仪分析纳米粒的形态、粒径和电位，其图谱如图5所示。从图5a的透射电镜图可以看出到纳米粒粒径约为50nm(黑点代表纳米颗粒)，与动态光散射粒度仪(图b)测定的水合粒径(55nm)相近。同时纳米粒分散性好，电位呈现为负值，能够在血液中达到长循环效果。

通过高效液相色谱法测定纳米粒中药物的包封率和载药量，其图谱如图6所示。该自组装纳米粒中阿霉素-二氯乙酸的包封率为76.5±6.5％，载药量为71.8±1.7％。相比之下，通过同样方法所制得的以dspe-peg2000为载体的阿霉素纳米粒的包封率仅为6.4±1.1％，载药量为17.6±2.4％。因此，偶联上二氯乙酸后可大大提高药物的自组装性能，进而提高药物的包封率和载药量。

为了考察纳米粒的存储稳定性，我们连续7天用动态光散射粒度仪测定纳米粒在pbs中的粒径，结果见图7。从图中可以看出，在常温下，阿霉素-二氯乙酸纳米粒的粒径几乎无变化，说明纳米粒稳定性好。

实施例3：降低dspe-peg2000含量时阿霉素-二氯乙酸的自组装纳米粒的制备及包封率和载药量的测定

纳米粒制备的具体操作步骤为：将1mg的阿霉素-二氯乙酸和0.15mg的dspe-peg2000(w/w,1/0.15)混合并溶于50μl的二甲亚砜中，在磁力搅拌下滴加至1ml的去离子水中。然后透析除去二甲亚砜，即可得到纳米粒。

通过高效液相色谱法测定纳米粒中药物的包封率和载药量，其图谱如图8所示。该自组装纳米粒中阿霉素-二氯乙酸的包封率为72.6±6.8％，载药量为82.8±1.3％。这说明阿霉素-二氯乙酸纳米粒的载药量非常高。

实施例4：阿霉素-二氯乙酸纳米粒的体内安全性研究

为了考察纳米粒的体内安全性，我们开展了最大耐受剂量实验。正常c57bl/6小鼠随机分组为7组，每组6只。在第0天，分别给予pbs，不同剂量的阿霉素(5、10或15mg/kgdox)和阿霉素-二氯乙酸纳米粒(25、50或75mgdox-dcanpsequiv./kg，这三组分别对应dox的剂量为25、50或75mg/kg)。在之后的10天里每天监测老鼠的体重，存活以及生理状态。最大耐受剂量的定义为：在10天内，老鼠的体重变化值小于15％且无其它明显毒性。10天后，老鼠全部处死，收集其血液及主要脏器(心，肝，脾，肺和肾)。测定血生化参数(丙氨酸氨基转移酶alt、天门冬氨酸氨基转移酶ast、乳酸脱氢酶ldh、血尿素氮和血清肌酐)并通过he染色观测组织损伤情况。

老鼠的体重变化情况和存活情况见图9。与dox给药组相比，纳米粒给药组的老鼠体重几乎没有下降。dox5mg/kg、10mg/kg以及15mg/kg组的体重下降最大值分别为4.2％、17.0％和24.0％。而在纳米粒给药组中，仅75mgdoxequiv./kg组有1.8％的体重下降，其它组则没有体重下降的情况发生。同时在dox15mg/kg这组中，有一只老鼠死亡，而其它给药组均没有老鼠死亡情况发生。因此，dox给药组的最大耐受剂量为5mg/kg，而纳米粒给药组为75mg/kg，这说明纳米粒体内安全性高，副作用低。

同时我们还进行了以上各组老鼠的血生化参数检测和病理学研究(图10)。dox15mg/kg给药组的谷丙转氨酶alt、谷草转氨酶ast和乳酸脱氢酶ldh水平显著提高，说明其肝脏和心脏毒性明显，而纳米粒组的血生化参数的水平无明显变化。在组织切片分析中，dox10mg/kg和dox15mg/kg给药组的心脏和肝脏也出现了明显的病变。在肝脏切片中，第二排图片为第一排图片中白色方框的放大图，以便更加清楚的观测组织损伤。其中心脏切片中有脂肪性空泡(黑色箭头)，肝脏切片中有明显炎症细胞浸润和肝细胞坏死(白色箭头)。相比之下，纳米粒给药组无可见毒性。

实施例5：阿霉素-二氯乙酸纳米粒的小鼠活体成像和离体组织分布结果

首先建立b16f10荷瘤小鼠模型，在c57bl/6小鼠右前肢近腋下皮下接种b16f10细胞悬浮液5×10⁴cells/0.2ml/只。待肿瘤长至500-1000mm³后，老鼠分为两组，分别给予游离荧光燃料dir和dir标记的阿霉素二氯乙酸纳米粒(dir@dox-dcanps)。在4h、8h、12h、24h和48h分别监测老鼠的体内荧光分布，同时于8h、24h和48h处死小鼠，收集其主要脏器并检测其荧光信号强度。

阿霉素-二氯乙酸纳米粒的肿瘤富集和体内分布情况如图11所示。1、2、3、4、5和6分别表示离体的肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织。与游离dir相比，dir@dox-dca纳米粒给药组有很好的肿瘤富集和滞留的效果(图11a)。同时在离体的器官分布中(图11b和c)，纳米粒也有很好的肿瘤靶向效果。在8h,24h和48h，纳米粒在肿瘤局部的信号强度分别是游离dir的47.2、48.2和39.4倍。另外，纳米粒在肿瘤局部的信号强度可以维持到48h。

实施例6：阿霉素-二氯乙酸纳米粒的抗肿瘤活性研究。

b16f10荷瘤小鼠模型建立如实施例4所示。小鼠随机分为4组，当肿瘤体积到50mm³左右时，小鼠分别尾静脉注射pbs、阿霉素5mg/kg(dox5mg/kg)、阿霉素-二氯乙酸纳米粒5mg/kg(dox-dcanps5mg/kg)和阿霉素-二氯乙酸纳米粒15mg/kg(dox-dcanps15mg/kg)，随后监测给药后肿瘤体积和体重的变化。第11天，处死老鼠，剥离肿瘤，拍照并称重。

肿瘤抑制结果如图12所示。从肿瘤生长曲线(图12a)、肿瘤剥离图(图12b)和肿瘤重量(图12c)的结果来看，pbs组肿瘤生长迅速，其余三组均有明显的肿瘤抑制效果，其中dox-dcanps15mg/kg的体内抗肿瘤活性最强。dox、dox-dcanps5mgdox/kg和dox-dcanps15mgdox/kg给药组的肿瘤抑制率分别为72.7％、62.3％和83.0％。从老鼠的体重变化情况来看(图12d)，pbs和纳米粒给药组体重呈上升趋势，而dox给药组体重无上升趋势且存在3％的体重下降，与pbs组相比有显著性差异。这说明纳米粒抗肿瘤效果好、体内安全性高。

综上所述，阿霉素-二氯乙酸纳米粒制备简单、载药量高、稳定性好、安全性高、肿瘤富集强和抗肿瘤效果好，是一个非常有潜力的抗肿瘤药物。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。