一种用于检测羊口疮病毒VIR基因的荧光定量PCR引物的制作方法

本发明涉及一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物，属于分子生物学领域。

背景技术：

羊口疮是由羊传染性脓疱病毒引起的羊接触性、嗜上皮性、人兽共患的传染病，各个年龄段的羊群都能感染发病，主要临床症状表现为嘴唇、口腔黏膜、外阴等出现丘疹或水疱，其中羔羊的危害最严重。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属成员，病毒的核酸为双线dna，基因组全长约145kb。目前广泛存在世界各国养羊国家和地区，我国新疆、内蒙、甘肃、吉林、山西、青海、宁夏、四川、黑龙江、福建等十几个省份均有该病发生和流行的报道，给养羊业造成较大的经济损失。

关于羊口疮病毒的诊断还没有通用标准，主要根据临床症状和实验室手段进行确诊。该病易与口蹄疫、羊痘等相混淆，同时容易引起激发感染。由于当前的疫苗免疫效果不理想，导致该病的防控异常困难。因此很有必要研制一种快速有效的早期诊断试剂盒。国内外有一些关于羊口疮病毒实时荧光定量pcr的报道，然所使用的基因多为b2l、f1l及dna聚合酶基因，未见有使用干扰素基因vir建立实时荧光定量pcr的方法，本发明根据羊口疮病毒干扰素基因vir序列设计特异性的引物，首次建立了针对羊口疮病毒vir基因的实时荧光定量pcr方法，以期为羊口疮在临床早期诊断和防治提供技术支持，填补了羊口疮病毒vir基因实时荧光定量pcr检测方法的空白。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测羊口疮病毒的引物，为羊口疮在临床早期诊断和防治提供技术支持，填补了羊口疮病毒vir基因实时荧光定量pcr检测方法的空白。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测羊口疮病毒的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-cgatatccggaaaggtcgttg-3’，

下游引物：5’-gctgttgatgaggatggtgag-3’。

利用本发明的引物可用于检测羊口疮病毒vir基因，尤其适用于基于sybrgreenⅰ荧光定量pcr技术的检测。通过对反应体系和反应条件的优化，建立了一套可用于检测羊口疮病毒的sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法。

一种用于检测羊口疮病毒的试剂盒，包含所述的引物。

具体方法如下：

1、引物设计：根据genbank上公布的羊口疮病毒km666563.1基因序列，针对对vir基因序列设计特异性的引物。

2、反应体系的优化：优化出的25μl最佳反应体系为：sybrpremixextaq2×12.5μl、上、下游引物（10μm）各1μl、模板2μl、双蒸水8.5μl。最佳反应条件为：95℃，30s预变性；95℃，5s，60℃，30s，共40个循环。

3、阳性标准品的制备：使用全式金病毒dna提取试剂盒提取dna，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行pcr扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

该方法可用于羊口疮病毒的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。

有益效果

本发明根据genbank登录的km666563.1的vir基因序列，设计特异性引物，建立针对羊口疮病毒vir基因建立sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法，该方法灵敏度高，最低可检测到100copies，特异性好、重复性好，可用于羊口疮病毒的临床诊断和流行病学调查。

附图说明

图1羊口疮病毒sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr方法的特异性扩增曲线。

图2为羊口疮病毒的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr的标准曲线。

图3为羊口疮病毒的sybrgreenⅰ实时荧光定量pcr的敏感性扩增曲线。

具体实施方式

实施例1羊口疮病毒的sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法的建立

一、材料：

大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌、羊口疮病毒为本研究室分离、鉴定和保存。

二、步骤

1、仪器与试剂：sybrpremixextaqⅱ（2×）、dl2000marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量pcr管购自axygen（美国）公司；mastercyclereprealplex荧光定量pcr仪，eppendorf（德国）公司产品。

2.引物的特异性

引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据genbank登录的km666563.1的vir基因序列，利用beacondesigner7.9软件设计引物，通过blast软件比对分析，初步验证其特异性。

3、阳性标准品的制备

以提取的dna为模板，使用全式金病毒dna提取试剂盒提取dna，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。

4.反应条件的优化

采用25μl反应体系(sybrpremixextaq2×)12.5μl，pcr上游引物（10μm）1μl，pcr下游引物（10μm）1μl，倍比稀释后的阳性标准品2μl，补水至终体积25μl，以出现最小的ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度（55～68℃）和引物浓度（0.2～1.0μm）进行优化。

5、建立标准曲线

用easydilution将构建的标准品梯度稀释(10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μl)作为模板，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

对阳性标准品的标准曲线和敏感性扩增曲线显示，sybrgreenⅰ荧光定量pcr方法对羊口疮病毒的最低检测限为100copies，且ct与拷贝数在1×10²-1.1×10⁷拷贝/μl，反应范围内有很好的线性关系，相关系数r²为0.998，扩增效率为112%。标准曲线见图2，敏感性扩增曲线见图3。

6特异性检测

6.1特异性检测

用优化的条件分别对羊口疮病毒大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌核酸样品进行检测，对该方法的特异性进行评价。检测结果显示，只有羊口疮病毒核酸样品为阳性，其余核酸样品检测结果均为阴性。见图1。

6.2重复性评估

对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量pcr进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃保存，分别于第7、14、21d重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为1.24%-2.75%，组间变异系数为1.63%～2.59%，可重复性好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>林裕胜

<120>一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物

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