一种Ty‑3分子标记的引物ACY及其标引方法与流程

本发明涉及一种ty-3分子标记的引物acy及其标引方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

番茄黄化曲叶病毒病（tomatoyellowleafcurldisease，tylcd）是由双生病毒科番茄黄化曲叶病毒（tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv）引起的一种在番茄（s.lycopersicum）生产上极具毁灭性的病害。20世纪30年代后期，在以色列首次报道了tylcd，20世纪60年代，该病害在地中海盆地番茄上大爆发（antignusetal.1994），随后蔓延到非洲，欧洲，亚洲，加勒比海和北美等地，该病害的发生在番茄中常造成巨大的产量损失，甚至高达100％（antignusetal.1994;picoetal.1996;czosneketal.1997;polstonetal.1997;delatteetal.2005）。1998年于广西南宁首次发现中国番茄黄化曲叶病（刘玉乐等,1998），随后tylcd在中国不同的番茄种植区也有发生。长久以来，通过对白粉虱群体数量的控制来防治tylcd，但由于白粉虱繁殖和传播能力非常强，传统的物理化学防治措施效果并不理想，而且化学试剂的使用虽可减少番茄的部分产量损失，但其易造成白粉虱抗药性以及环境污染的加剧（cahilletal.1996a,1996b;elbertandnauen2000;picóetal.1996;mccauleyetal.2006;chowdhuryetal.2013）。因此，解决该病害最为经济有效环保的措施是培育抗病品种，从根本上防治番茄黄化曲叶病毒病。

迄今为止，已经鉴定出的来自野生番茄中的抗ty基因有：ty-1，ty-2，ty-3，ty-3a，ty-4和ty-6，特别是来自智利番茄的ty-1被认为是番茄抗病育种的主抗病基因源，随后被证明其与ty-3是等位基因（verlaanetal.2011,2013）。随着分子生物学的发展，分子标记被广泛用于番茄的标记辅助选择育种，包括caps，snp和scar标记，已经设计了许多ty-1/ty-3相关的分子标记。然而，大多数分子标记与抗性基因之间有一定距离，在标记过程中会出现因连锁标记与抗病基因交换而产生的假阳性（jietal.,2007，2012）。此外，有些标记如caps标记，在实际应用中需要经过pcr扩增和用限制性内切酶酶切扩增产物这两个漫长的步骤，这使得它们的基因分型耗时长，且成本昂贵。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供本发明提供了一个稳定准确高效的ty-3基因特异性的功能标记引物acy。该标记引物acy可避免在实际应用中出现因交换而产生的假阳性，使检测结果更加准确可靠，在番茄抗ty育种中可以广泛应用，能够更有效防止黄化曲叶病毒病发生。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种番茄黄化曲叶病抗性基因ty-3分子标记的引物acy，所述番茄ty-3抗性基因特异性标记引物序列为：

正向引物序列为f：5'-ccttatgatgtctcgtgaaagg-3'

反向引物序列为r：5'-gaagcacagattgaagaaaacc-3'。

进一步地，所述标记引物acy对抗病品种扩增出132bp的片段大小，分子标记对感病品种扩增出123bp片段。

一种标记番茄黄化曲叶病抗性基因ty-3的方法，采用上述引物acy对目标材料的dna进行pcr扩增，对扩增产物进行检测，若能扩增出132bp的扩增片段，则表明该杂交后代含有番茄黄化曲叶病抗性基因ty-3，否则则表面不含有番茄黄化曲叶病抗性基因ty-3。

进一步地，所述pcr扩增反应体系为25μl，包括12.5μl2×taqmastermix，1μldna提取物，10μm的正反向引物各1μl，9.5μlddh2o，反应程序为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。

进一步地，所述扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离pcr扩增的片段，进行银染，并在白光下显现扩增的dna条带。

进一步地，还包括通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测目标材料dna的质量与浓度。

分子标记的引物acy在筛选抗黄化曲叶病毒病番茄品种中的应用，通过引物acy,可以稳定可靠地筛选出抗黄化曲叶病毒病番茄品种，防止灾害发生。

本发明的有益效果是，对番茄黄化曲叶病毒病抗感两种材料的番茄叶片基因组dna进行pcr扩增，获得了区分抗病品种与感病品种准确高效的分子标记，标记稳定可靠，有利于番茄分子标记辅助选择育种，本发明设计的ty-3特异性分子标记引物，在抗病品种中扩增出132bp，感病品种中扩增出123bp的条带，条带清晰，且由于是在基因区内设计的引物，所以不会发生因交换而产生的假阳性，保证了鉴定结果的准确可靠性，其鉴定结果与所用材料的田间表型完全一致。利用该分子标记辅助选择抗病品种，操作简便，节约时间和成本。通过本发明，只需简单提取番茄叶片基因组dna，然后进行pcr扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可有效的鉴定番茄材料是否抗ty-3，选择抗病品种。不仅避免了常规育种方法繁琐的筛选过程，更重的是避免了连锁标记在实际应用中出现因交换而产生假阳性，使得抗病性鉴定结果更加准确可靠高效。在扩增之前通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测目标材料dna的浓度，从而保障用于扩增的dna质量良好，进一步保障标记结果。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1.新标记acy引物设计与dna序列模式图。

图2.四个番茄商品品种测序结果。

图3.功能标记acy筛选结果。

图4.连锁标记p6-25筛选结果。

图5.f2群体在聚丙烯酰胺凝胶中扩增结果。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

实施例一：

本实施例根据野生番茄（solanumpennellii）与栽培番茄（solanumlycopersicum）基因组序列，在ncbi数据库中利用blast工具进行序列比对ty-3候选基因solyc06g051170的序列，发现存在单个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基，甚至9个碱基、10个碱基的缺失。根据9个碱基与10个碱基的缺失，用设计引物，用6个抗病商品品种与6个感病商品品种进行pcr扩增，发现据10bp的缺失设计的引物可以很好的区分抗感病品种，且带型明显、清晰，扩增出的抗病品种的条带大小为132bp,而感病品种的片段大小为123bp。预测该indel标记位于番茄6号染色体，ty-3候选基因solyc06g051170片段的第4个内含子的位置，如图1中a、b、c所示,a表示番茄6号染色体上标记acy的初步绘制位置；b表示ty-3基因位点solyc06g051170的预测结构（由12个外显子和11个内含子组成），indel缺失在第4个内含子的位置；c表示野生番茄与栽培番茄基因序列10bp的插入缺失比对。

由于该标记扩增出的基因片段大小在130bp左右，为了方便连载体进行测序，我们在该标记的前后各设计了新的引物seq-f，seq-r，如图1中d所示,d表示引物设计的模式图，其中x表示indel插入缺失的位置；a表示通过引物对acy-f和acy-r（132或123bp）扩增的dna片段；b表示用来测序的经seq-f和seq-r（630bp）扩增的dna片段。

利用丰满7号和丰满4号两个抗病品种，hi-techo1和hi-techo2两个感病品种进行pcr扩增，连接t载体，进行测序，发现相较于抗病品种丰满7号和丰满4号，感病品种hi-techo1和hi-techo2中确实存在10bp的缺失，如图2所示。

对已知抗性的36个商品品种材料用功能标记acy进行pcr扩增验证，所有抗病品种均扩增出了132bp的条带，所有感病品种扩增出123bp的条带，如图3所示。pcr结果与田间鉴定结果一致，说明这个标记完全可以鉴定番茄黄化曲叶病的抗病性。另外，用番茄ty-3基因的连锁标记p6-25（f:ggtagtggaaatgatgctgctc，r:gctctgcctattgtcccatatataacc）进行36个商品品种pcr扩增，发现在爱吉115、东风601和农博粉霸1510号3个品种分子标记结果与田间表型不一致，可能是由于连锁标记p6-25与抗病基因ty-3存在一定的距离，如图4所示。其中，图3中，功能标记acy基于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛选，m表示500bp的marker，图4中，连锁标记p6-25基于琼脂糖凝胶的分子筛选结果，m为2000bp的marker；*表示抗病基因与连锁标记之间发生交换，1=粉贝贝，2=千禧，3=黄榕，4=佳西娜（74-112），5=曼西娜（73-47），6=福特斯72-152，7=满田2025，8=hi-techo1，9=hi-techo2，10=豫艺亮晶晶，11=澳美1号，12=欧盾，13=爱吉112，14=爱吉115，15=爱吉158，16=爱吉1330，17=丰满7号，18=丰满4号，19=东风601，20=农博粉霸1510号，21=中华绿宝，22=京番102，23=多喜13-1，24=农情12-7，25=金棚m703，26=天宝326，27=雅宝，28=罗拉，29=倍盈，30=齐达利，31=丰收74-560，32=爱吉208，33=满田2218，34=满田2199，35=京番502，36=红双喜（4224）。

采用本实施中的标记引物acy的标记方法和验证结果如下：

（一）材料与方法

1.植物材料

本研究使用36个已知抗病性的番茄商品品种（表1）以及111个番茄f2分离群体，其中商品品种来自中国不同地区的29个抗ty品种和7个感病品种，而f2分离群体是由江苏绿港现代农业发展公司（简称绿港）提供。根据绿港的实验方法进行播种，定植以及田间管理。为了进行tylcv表型的筛选，将番茄种植在温室中以满足白粉虱入侵的关键期。

2.dna的提取与检测

使用植物基因组dna试剂盒（cwo531m）（北京康为世纪生物科技有限公司）从30天的新鲜植物叶中提取番茄基因组dna。

琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测dna的质量与浓度。

3.引物的设计

根据ty-3候选基因solyc06g051170的基因组序列，在ncbi数据库中利用blast工具对栽培番茄与野生番茄序列进行比对，预测抗性等位基因序列来自于野生型番茄，而感病等位基因序列来自于栽培番茄。利用抗感两序列的差异，开发了ty-3基因特异性的功能标记，用primer5.0软件设计引物。新标记acy在抗病品种中扩增出132bp的多态性dna片段，而在感病品种中扩增出123bp的片段。

正向引物序列为f：5'-ccttatgatgtctcgtgaaagg-3'

反向引物序列为r：5'-gaagcacagattgaagaaaacc-3'

4.pcr扩增及检测

pcr扩增在中国华盛公司ly96gthermocyclertm扩增仪上进行，反应体系为25μl，包括12.5μl2×taqmastermix，1μldna提取物，10μm的正反向引物各1μl，9.5μlddh2o。反应程序为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸2min，然后反应保持在4℃。在8％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离pcr扩增的片段，进行银染，并在白光下显现。

5.单株验证

通过种植36个番茄商品品种与111个f2分离群体，采用采用温室白粉虱侵染苗期接种鉴定，田间病害分级标准参考huttonandscott(2014)。提取各材料基因组dna，用新标记acy进行扩增，将田间鉴定结果与分子标记结果对比，完成单株验证。

（二）结果与分析

1.所选材料的基因组dna的检测分析

使用超微量紫外可见分光光度计（denovixds-11）对本研究所提取的147个番茄叶片基因组dna进行浓度检测，发现提取的dna浓度均高于100ng/μl，而且od260/od280基本都在1.8~2.0之间。取不同浓度dna用2%的琼脂糖电泳检测，电泳图清晰明亮，无明显拖尾，说明提取的dna质量较好。所以，提取到的高质量番茄叶片基因组dna，适用于pcr扩增、ssr等分子标记的生物学试验。

2.pcr扩增与田间验证

应用本发明的番茄ty-3基因特异性标记f:5'-ccttatgatgtctcgtgaaagg-3'和r:5'-gaagcacagattgaagaaaacc-3'对36个番茄商品品种进行扩增，结果见图3，图中可以清晰的看出，在感病品种中扩增出一条123bp的条带，而在抗病品种中扩增出132bp大小的片段，且田间表型与分子标记结果完全一致（表1）。

2017年种植f2代分离群体，共111个单株。采用温室白粉虱侵染鉴定，结果表明：在调查的111株f2群体中，有75株表现为抗病，其中60株表现为0型，10株表现为1型，5株表现为2型；36株表现为感病，其中25株表现为3型，11株表现为4型，如表2所示。经卡方测验，f2分离群体分离结果符合3:1的比例(x2=3.26,x20.05,1=3.84)。

注:r：抗病株数；s:感病株数；x2检验显示，在置信水平为0.05时，x2值都小于x20.05(3.84)，f2代分离群体的抗感比没有偏离预期值(3:1)。

f2代分离群体的电泳结果见图5，图中可以清晰的看出，75株（0dsl~2dsl）扩增出了抗病的132bp的条带，而36株(3dsl~4dsl)扩增出了感病的123bp的条带，分子标记结果与田间判断结果吻合。抗感品种条带的明显分离，说明这对标记可以准确可靠的检测抗感品种。在图5中，m表示500bp的marker；0dsl表示在田间表型为0级；1dsl表示在田间表型为1级；2dsl表示在田间表型为2级；3dsl表示在田间表型为3级；4dsl表示在田间表型为4级。

因此，采用本发明的引物acy，可以非常准确地筛选抗黄化曲叶病毒病番茄品种，防止灾害发生。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

<110>

<120>一种ty-3分子标记的引物acy及其标引方法

<160>2

<170>primer5.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>acy(正向引物序列)

<400>1

ccttatgatgtctcgtgaaagg22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<223>acy(反向引物序列)

<223>2

gaagcacagattgaagaaaacc22