一株马胃葡萄球菌ZH810及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及马胃葡萄球菌(staphylococcusequorum)，具体涉及一株分离自腐乳的马胃葡萄球菌zh810及其在毛霉型腐乳生产中的应用，属于生物发酵技术领域在腐乳加工行业的应用。

背景技术：

腐乳作为一种传统的大豆发酵食品，在中国已有千年历史。现代腐乳生产厂家大多采用人工接种纯种毛霉发酵。虽然采用纯种发酵产品质量相对稳定，但由于采用纯毛霉发酵存在酶系相对单一，且酶活力不高等缺点，进而造成腐乳产品风味不足，满足不了现代人们的饮食需求。

蒋立文等(将芳芳，刘嘉，蒋立文，《腐乳品质改善的研究进展》，中国酿造，2011年第11期：第1-5页)指出，腐乳特殊的色、香、味主要是毛霉和其他微生物共同发酵作用的结果。现代腐乳纯种发酵模式导致其他有益微生物的缺失，从而引起腐乳产品风味存在明显不足。

为了解决上述问题，中国发明专利cn104041727b《一种腐乳风味增强发酵剂及其制备方法》通过制备由毛霉和根霉的菌体破碎物、酵母抽提物、低聚果糖复配而成的风味增强发酵剂，参与腐乳后发酵过程，达到提升腐乳风味的目的。中国发明专利申请cn102885166a《一种腐乳的生产工艺及腐乳》通过在腐乳后酵期间加入芳香类植物物质，使各种芳香类植物味道深入腐乳，最终制得风味独特且口味丰富的腐乳。上述专利或者专利申请均通过添加腐乳发酵体系外的物质来实现腐乳风味的提升。一方面，添加腐乳发酵体系外的物质大大增加了生产成本，不经济；另一方面，外源物质的添加也易引起腐乳风味的改变。

中国发明专利cn102197847b《一种多菌种混合发酵生产腐乳的方法》通过在前酵阶段使用含有毛霉、米曲霉和黑曲霉的混合菌种制胚；在后酵阶段接种增香酵母菌的方式，达到丰富腐乳风味的目的。中国发明专利申请cn101658273a《低盐腐乳的生产方法》通过添加由芽孢菌、酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉组成的益生菌复合发酵剂汤料来保证低盐后发酵，形成特有风味。上述专利或者专利申请均通过引入复合菌种的方式来参与腐乳后期发酵，以实现改善腐乳风味的目的。但上述复合菌群中的菌株并非均来源于传统腐乳发酵体系，其在腐乳后发酵体系中的生存及作用能力均存在很大的不确定性；另外，外来菌群的引入同样可能会大幅度改变腐乳特有的风味。

中国发明专利cn102827771b《一种腐乳专用生产发酵剂及其制备方法》通过使用藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌等菌株复配而成的复合菌剂制备腐乳。一方面，该专利的菌剂制备生产成本高昂；另一方面，该菌剂的适用范围仅限于细菌型腐乳的生产，并不适用以毛霉为主要发酵菌株的腐乳品类。

技术实现要素：

为了解决目前毛霉型腐乳纯种发酵模式导致其他有益微生物的缺失从而引起腐乳产品风味存在明显不足的问题，本发明人通过从传统风味良好的腐乳产品中分离、筛选与风味具有密切关系的菌株，并对其在腐乳生产中的应用方式进行了研究，以提升腐乳产品风味。

本发明不仅避免了外源风味物质的添加导致的成本上升及风味改变问题；而且，筛选所获菌株来源于毛霉型腐乳本身发酵体系中，避免了外源菌群作用的不确定性以及风味问题。

在一个方面，本发明提供一种分离自腐乳的马胃葡萄球菌zh810及其在腐乳生产中的应用，用以解决目前毛霉型腐乳纯种发酵模式下导致产品风味不足的问题，提升腐乳产品风味、质量。

本发明所涉及到的马胃葡萄球菌zh810，已于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075，保藏编号为gdmccno：60182。

在又一个方面，本发明提供本发明的马胃葡萄球菌zh810在制备腐乳中的用途。

在另一个方面，本发明提供制备腐乳的方法，其中将本发明的马胃葡萄球菌zh810应用于发酵腐乳。

在一个实施方案中，本发明的马胃葡萄球菌zh810参与腐乳前发酵阶段。

在另一个实施方案中，本发明的马胃葡萄球菌zh810参与腐乳后发酵阶段。

在本发明中，腐乳前发酵阶段是指前期培菌的过程，是菌种在豆腐白坯上生长代谢，同时生成的菌丝体包裹坯体成型、蛋白质部分降解成水溶性蛋白质的过程。腐乳后发酵阶段是指坯体中的蛋白质等大分子物质在前期培菌中分泌的酶系与后酵时加入的汤料中的微生物和化学物质的协同参与下降解与酯化成香的主要过程。

本发明通过以下技术方案予以实现：

1、目的菌株的富集、筛选培养基配制；

液体培养基：通过模拟传统腐乳发酵体系的营养特点及成分组成，复配出能够富集得到腐乳发酵体系中与风味形成密切相关的菌株培养基。该培养基配方为：市场成品广东白腐乳汁200g，检测nacl含量，调腐乳汁中nacl含量至70±0.5g/l(不足加nacl，过量加入水稀释)，ph调节至6.5±0.2，121℃灭菌15min。

固体培养基：在液体培养基的基础上添加2％的琼脂粉，121℃灭菌15min。

2、目的菌株的富集、筛选策略；

本发明中的马胃葡萄球菌先通过液体培养基富集，再通过稀释平板法筛选获得。首先，在广东省各大商场购买合格的传统腐乳发酵成品，无菌条件下筛选腐香风味浓郁的样品，并立即将样品汤液接种至上述液体培养基中；置于25℃恒温培养箱中，培养72h获得发酵液。

品评人员由从事腐乳研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。每个样品由八位品评人员分三次进行品评。在20℃的品评环境下，评价发酵液的风味，挑选出最优发酵腐乳风味的样品，完成目的菌株的富集操作。

将富集得到的产腐香菌液接种于上述固体培养基中，于25℃培养72h后；筛选、观察菌落形态；并对菌株进行革兰氏染色，观察其菌体形态；并通过16srdna序列分析对目的菌株完成鉴定。

本发明中马胃葡萄球菌zh810的生物性状特征如下：在上述培养基平板上菌落突起，呈圆形(略不规则)，直径1-3mm，灰白色，不透明，湿润光滑；菌体为革兰氏染色阳性球菌，呈单、双、链、堆状排列。将所测16srdna序列(如seqidno：1所示)通过blast比对，使用mega4.1软件构建微生物系统进化树，鉴定其为马胃葡萄球菌，并命名为马胃葡萄球菌zh810。

3、目的菌株在腐乳生产中的应用；

本发明提供马胃葡萄球菌zh810在毛霉型腐乳生产中的应用。

该应用方法包括：

(1)制备上述液体培养基，扩培马胃葡萄球菌zh810，获得生产用菌液。

(2)将上述生产用菌液离心获取菌体，使用毛霉孢子菌悬液复溶后，获得复合种子液；接种至豆腐白坯表面，参与腐乳前发酵，进入腐乳发酵体系。毛霉孢子菌悬液的制备：将100～200g豆腐块(含水量以65％～75％为宜)分装至300～500ml三角瓶中，121℃灭菌15～20min，冷却后，接种雅致放射毛霉as3.2778，培养60～72h后；在无菌条件下，向培养好的三角瓶内加入150～300ml无菌水，振荡，洗脱培养基表面的孢子，得到孢子悬浮液。显微镜下计数，使孢子悬浮液浓度达到10⁵～10⁶个/ml。

(3)亦可将上述生产用菌液按照适宜的体积比例加入到腐乳后酵期间的发酵汤料中，共同参与后发酵。

(4)马胃葡萄球菌zh810亦可通过常用细菌培养基进行培养，培养后离心获取菌体；使用毛霉菌悬液或发酵汤料复溶后，引入到腐乳发酵体系中。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

(1)在腐乳发酵期间，将本发明的马胃葡萄球菌zh810接入到腐乳发酵体系中，明显提升腐乳风味。经济、高效地解决了毛霉型腐乳纯种发酵模式下，腐乳风味不足的问题；

(2)通过从传统风味良好的腐乳中富集、筛选有益菌株来改善腐乳风味，避免了外源香辛料、外源菌群的引入。对保持腐乳传统风味及食品安全性具有重要意义。

(3)该菌株产香速度快，培养条件简单，易于工业化生产；在腐乳生产中具有良好的开发应用前景。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为本发明马胃葡萄球菌zh810菌株的菌落形态图。

图2为本发明马胃葡萄球菌zh810菌株的菌体形态图。

图3为本发明马胃葡萄球菌zh810菌株的16srdna序列(seqidno：1)。

图4为根据16srdna序列对本发明马胃葡萄球菌zh810菌株所绘制的微生物系统进化树。

生物保藏信息

一株马胃葡萄球菌zh810，于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075，保藏编号为gdmccno：60182。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

目的菌株的富集

(1)液体培养基配制

通过模拟传统腐乳发酵体系的营养特点及成分组成，复配出能够富集得到腐乳发酵体系中与风味形成密切相关的菌株培养基。该培养基配方为：市场成品广东白腐乳汁200g，；检测nacl含量，调腐乳汁中nacl含量至70±0.5g/l(盐分不足加入nacl，盐分过量加水稀释)，ph调节至6.5±0.2，121℃灭菌15min。

(2)目的菌株的富集筛选

本发明中目的菌株的获得，首先通过上述液体培养基富集。在广东省各大商场购买合格的传统腐乳发酵成品，无菌条件下筛选腐香风味浓郁的样品，并立即将样品汤液接种至上述液体培养基中；置于25℃恒温培养箱中，培养72h获得菌液。

本实施例还召集八位品评人员对样品进行感官鉴评，品评人员由从事腐乳研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。在本实施例中，每个样品由八位品评人员分三次进行品评，具体品评标准详见表1。

表1发酵液风味评价标准

在20℃的品评环境下，品评人员评价发酵液的风味，各个发酵液样品评价结果见表2。

表2发酵液样品评价结果

由表2中的结果可知，发酵液样品3感官风味最佳，因此，挑选发酵液样品3作为包含目的菌株的样品，由此完成目的菌株的富集筛选。

实施例2

目的菌株的分离、鉴定

将实施例1中富集得到具有良好风味的发酵液样品3进行常规稀释用于获得单菌落。将发酵液样品3稀释后，涂布于固体培养基上，于25℃培养72h后。挑选单菌落，进行平板划线分离，如此重复4-5次，直至获得纯的单菌落，于4℃冰箱内保存。

固体培养基配制：在液体培养基的基础上添加2％的琼脂粉，121℃灭菌15min。

观察目的菌株的菌落形态并对目的菌株进行革兰氏染色，观察其菌体形态；并通过16srdna序列分析对目的菌株完成鉴定。

本发明中目的菌株的生物性状特征如下：在上述培养基平板上菌落突起，呈圆形，直径1-3mm，灰白色，不透明，湿润光滑；菌体为革兰氏染色阳性球菌，呈单、双、链、堆状排列(如图1和图2所示)。

将所测16srdna序列(seqidno：1，见图3)通过blast比对，使用mega4.1软件构建微生物系统进化树(见图4)，鉴定目的菌株为马胃葡萄球菌，并命名为马胃葡萄球菌zh810。

实施例3

马胃葡萄球菌zh810在毛霉型腐乳生产中的应用

(1)马胃葡萄球菌zh810菌液的培养

将马胃葡萄球菌zh810接种至液体培养基中，于25℃培养72h获得菌液；液体培养基的配方与实施例1中的相同。另外，该菌株亦可使用商用细菌培养基进行培养，但需要离心获取菌体后才可加入到腐乳发酵体系中。

(2)马胃葡萄球菌zh810在腐乳生产中的应用

①马胃葡萄球菌zh810在腐乳前发酵阶段引入到发酵体系

将步骤(1)获得的马胃葡萄球菌zh810菌液经5000r/min离心10min获得菌体，使用腐乳前发酵阶段接种使用的毛霉孢子菌悬液复溶菌体(每10～100ml马胃葡萄球菌zh810菌液离心获得的菌体使用1l～10l毛霉孢子菌悬液复溶)；由此获得毛霉孢子与马胃葡萄球菌zh810的复合菌悬液，按照1‰～1％的比例接种至豆腐块表面，一同参与腐乳前发酵阶段。

毛霉孢子悬浮液采用雅致放射毛霉as3.2778菌株制备：将200g豆腐块(含水量65％)分装至500ml三角瓶中，121℃灭菌15min，冷却后，接种雅致放射毛霉as3.2778(购自中科院微生物所)，培养60h后；在无菌条件下，向培养好的三角瓶内加入300ml无菌水，振荡，洗脱培养基表面的孢子，得到孢子悬浮液。显微镜下计数，使孢子悬浮液浓度达到10⁵个/ml。

风味感官鉴评标准详见表3，风味感官鉴评结果见表4。

表3腐乳感官鉴评标准

表4腐乳前酵阶段引入马胃葡萄球菌zh810感官鉴评结果

由表4中的结果可知，在腐乳生产前发酵阶段引入马胃葡萄球菌zh810，其能够充分参与腐乳整个发酵过程，不仅可以赋予腐乳优良的风味及口感，并且产香速度快。

②马胃葡萄球菌zh810在腐乳后发酵阶段引入到发酵体系

将步骤(1)获得的马胃葡萄球菌zh810菌液与腐乳进入后发酵所需的汤料混合，混合比例为体积比1％～20％。将混合后的汤料按照正常生产工艺灌装至腐乳后发酵半成品中。另外，该菌株亦可使用商用细菌培养基进行培养，经过离心操作获取马胃葡萄球菌zh810的菌体，使用汤料复溶(每10～100ml马胃葡萄球菌zh810菌液离心获得的菌体使用1l～10l汤料复溶)，按照1％～20％的比例分散至腐乳生产汤料中，参与腐乳的后发酵过程。

风味感官鉴评结果见表5。

表5腐乳后酵阶段引入zh810感官鉴评结果

由表5中的结果可知，马胃葡萄球菌zh810充分参与腐乳的后发酵过程，可赋予腐乳优良的风味及口感，加快产香速度。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110>佛山市海天（高明）调味食品有限公司

佛山市海天调味食品股份有限公司

佛山市海天（江苏）调味食品有限公司

<120>一株马胃葡萄球菌zh810及其应用

<130>idc170167

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1397

<212>dna

<213>马胃葡萄球菌（staphylococcusequorum）

<400>1

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