本发明涉及化学
技术领域：
，具体来说涉及一种含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物、该化合物的制备方法以及对黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌具有抑制作用的用途。
背景技术：
：黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)属于雀麦花叶病毒科成员，是分布最广，危害最重，最具经济重要性的病毒之一。世界范围内左右烟草和蔬菜种植区均有该病毒的分布和危害，烟草和蔬菜感染后造成产量和品质下降，甚至绝收，给农业生产带来严重经济损失(沈小英,宋双,罗晶,张鑫,安德荣.抗烟草黄瓜花叶病毒多糖筛选及其对烟草防御酶活性的影响[J].微生物学报,2013,53(08):882-888.)。目前有效而令人满意的抗植物病毒剂实用化品种还不多，尤其特效的治疗性药剂更少，所报道的药剂在田间实际应用其防效大多在60％以下。为此，创制出高效、新型的抗黄瓜花叶病毒药剂迫在眉睫。烟草是重要的经济作物，由茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的烟草青枯病危害巨大。该病是典型的维管束病害，烟草根、茎、叶各部位均可被感染，病株根部变黑腐烂，对烟草造成毁灭性的危害(刘伟,刘鹏,沈小英,安天赐,成巨龙,安德荣.烟草青枯病拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抑菌活性初探[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2014,42(02):123-130.)。目前在我国主要产烟省区均有发生。目前针对烟草青枯病菌尚无理想的抗病品种，开发有效的化学防治药剂已收到国内研究者的重视。1995年，中国科学院成都生物研究所的向固西等(向固西,胡厚芝,陈家任,陈维新,吴林森.一种新的农用抗生素——宁南霉素[J].微生物学报,1995,35(5):368-374.)从诺尔斯链霉菌西昌变种的发酵液中提取了胞嘧啶核苷肽型抗生素宁南霉素(ningnanmycin)。在我国四川省和云南省对其进行多点防治试验，示范结果表明：宁南酶素对烟草花叶病的防治效果为69.4％～95.4％，平均增产效果为26.1％，均优于植病灵、菌毒清和NC-83，并可使烟叶的内在质量明显提高。在温室内施药间隔3-10d后，人工分别接种CMV、TMV和PVY，实验表明宁南酶素对CMV和TMV所引起的烟草花叶病的防治效果高达90.9％和92.9％，对PVY引起的烟草花叶病的防治效果高达53.8％。茉莉酸酯(jasmonates,Jas)是新发现的一种植物内源激素，代表物是茉莉酸(jasmonicacid,JA)和茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MJ)。Creelmna等(CreelmnaRA；MellutJE.Biosynthesisandactionofjasmonatesinplnat[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1997,48:355-381)研究发现JAs在植物的抗病中起作用，是抗病信号的传递体之一，在植物抗病中参与了局部和系统的抗性。为创制新型高效的抗黄瓜花叶病毒剂，本发明在前期工作的基础上，利用活性基团拼接原理，将嘧啶杂环引入氨基酸酯结构中，设计合成了系列含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，期望筛选出高活性的抗黄瓜花叶病毒和烟草青枯病菌的药物。技术实现要素：本发明目的在于提供一种具有抗黄瓜花叶病毒和烟草青枯病菌活性的含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物及其制备方法。本法明的另一目的在于防治黄瓜花叶病毒病(CMV)和烟草青枯病菌的用途。本发明的一种含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，其通式为下式(I)：其中：R1为苯基、单取代苯基、对位单取代甲氧基苯基、对位单取代甲基苯基、环己基或呋喃甲基；R2甲基或乙基。本发明含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，已合成化合物为：化合物I1：二乙基-2-(((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸；化合物I2：二乙基-2-((4-(甲氧基苯基)((4-甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(甲基)丙二酸；化合物I3：二乙基-2-((4-氯苯基)(4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(甲基)丙二酸；化合物I4：二乙基-2-(环己基)((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(甲基)丙二酸；化合物I5：二甲基-2-(((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸；化合物I6：二甲基-2-(((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(苯甲基)丙二酸；化合物I7：二乙基-2-(呋喃-2-基)((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(甲基)丙二酸；化合物I8：二乙基-2-(环己基)((4-(甲基-6-哌啶-1基)嘧啶-2-基)氨基)(甲基)丙二酸；本发明含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的制备方法，是以2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶、取代醛、丙二酸酯为原料，对二甲苯为溶剂，微波一锅法合成含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物，其合成路线为：其中部分化合物(I1-I2)的结构特征如下：本
发明内容所述的一种含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的制备方法，经下列步骤合成：将2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶、取代醛、丙二酸酯投入单口瓶，加入对二甲苯，微波加热至100℃，反应50分钟结束，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物I1-I8，本发明含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的用途是指对黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌均具有抑制作用的药物或药剂。本发明的有益效果：本发明合成了对黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌均具有抑制作用的4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物。目前无此类化合物可同时用于防治黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌方面的报道，本发明合成路线合理，合成原料易得，操作简单，反应收率较高。并且本发明中的化合物I2对黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌均具有抑制作用。并且I2在防治黄瓜花叶病毒方面，无论是治疗、保护还是钝化活性，均优于对照药剂宁南霉素。化合物I2在200和100ug/mL浓度下对烟草青枯菌的抑制率为100％与商品化对照药剂噻菌铜相当。另外，本发明，还对生物活性最优的化合物I2的制备方法进行了深入的研究，并最终确定本发明中活性最优化合物I2的连续生产制备方法。附图说明图1为利用MCT微反应器连续制备I2示意图。具体实施方式实施例1：化合物I1的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例2：化合物I2的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、4-甲氧基苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例3：化合物I3的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、4-氯苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例4：化合物I4的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、环己基甲醛(0.001mol)、丙二酸二乙酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例5：化合物I5的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例6：化合物I6的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、对甲基苯甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例7：化合物I7的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、糠醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。实施例8：化合物I8的合成：在100mL单口瓶中，加入2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶(0.001mol)、环己基甲醛(0.001mol)、丙二酸二甲酯(0.0015mol)，加入对二甲苯(30mL)为溶剂，微波100℃下，50分钟后结束反应，减压回收对二甲苯，经过柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得到目标产物。对上述实施例1-8合成的含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物的收率、物理形态与元素分析如表1所示，核磁共振氢谱(1HNMR)数据如表2所示、核磁共振碳谱(13CNMR)数据如表3所示，红外光谱(IR)数据如表4所示，质谱(MS)数据如表5所示：表1目标化合物的理化性质与元素分析表2目标化合物的1HNMR数据表3目标化合物的13CNMR数据表4目标化合物的红外数据化合物IR(KBr)(cm-1)I13378,2973,1736,1553,1431,1237,1172,826,791I23481,2962,1738,1571,1446,1243,1163,858,790I33411,2927,1742,1567,1465,1258,1169,920,762I43379,2980,1733,1578,1454,1243,1190,852,788I53391,2969,1727,1570,1437,1247,1173,858,779I63490,2961,1741,1569,1448,1251,1171,864,790I73400,2926,1728,1579,1451,1243,1172,927,778I83388,2991,1730,1577,1454,1240,1165,881,792表5目标化合物的质谱化合物MS(ESI):m/zI1441([M+H]+),463([M+Na]+),479([M+K]+).I2471([M+H]+),493([M+Na]+),509([M+K]+).I3475([M+H]+),497([M+Na]+),513([M+K]+).I4447([M+H]+),469([M+Na]+),485([M+K]+).I5413([M+H]+),435([M+Na]+),451([M+K]+).I6427([M+H]+),449([M+Na]+),465([M+K]+).I7403([M+H]+),425([M+Na]+),441([M+K]+).I8419([M+H]+),441([M+Na]+),457([M+K]+).实施例9、目标化合物抗黄瓜花叶病毒治疗、钝化和保护活性(1)测试方法A.病毒提纯采用周雪平方法(Zhou,X.P.；Xu,Z.X.；Xu,J.；Li,D.B.J.SouthChin.Agric.Univ.1995,16,74-79)，选取接种3周以上，CMV系统侵染寄主Nicotianatabacum.L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经过2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到CMV精提液体。整个实验在4℃下进行，用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度，根据公式计算病毒浓度。病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％1cm260nm其中E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为l厘米时的光吸收(光密度)值。CMV的E0.1％1cm260nm是5.0。B、药剂对CMV侵染的活性治疗作用：选长势一直的5-6叶期笕色黎打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。待叶片干后，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度作为对照，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。C、药剂对CMV侵染的活体保护作用药剂对CMV侵染的活体保护租用：选长势一直的5-6叶期笕色黎打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应浓度的溶剂作对照，24小后向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，用清水冲洗，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。D、药剂对CMV侵染的活体钝化作用药剂对CMV侵染的活体钝化作用:选长势一直的5-6叶期笕色黎打顶，向全叶撒匀金刚砂，用磷酸缓冲液将CMV；病毒稀释至6×10-3mg/mL，将化合物与等体积的病毒汁液混合钝化30分钟，用排笔人工摩擦接种于撒有金刚砂的适龄笕色黎左半业，对应剂量的溶剂与病毒汁液混合接种于撒有金刚砂的适龄笕色黎右半叶，6-7天后记录枯斑数，按下列公式计算抑制率。X％＝(CK－T)/CK×100X:相对抑制率(％)；CK:未涂施药剂半叶的平均枯斑数；T:涂施药剂半叶的平均枯斑数；其中，CK与T都采用各组三次重复的平均数。(2)生物测试结果表6目标化合物对黄瓜花叶病毒的治疗、保护、钝化活性化合物浓度(μg/mL)治疗效果(％)保护效果(％)钝化效果(％)I150042.9±2.847.8±1.364.2±1.5I250054.5±2.267.2±1.693.1±3.4I350033.1±3.153.4±2.163.2±2.5I450023.3±2.133.5±2.652.3±2.8I550022.3±3.138.2±2.351.1±1.2I650042.3±0.948.3±1.058.8±0.9I750024.5±1.137.2±1.344.1±1.2I850046.3±2.159.9±3.782.3±1.8宁南霉素50050.0±2.264.6±2.892.3±2.7采用半叶枯斑法，浓度为500mg/L，以宁南霉素为对照药剂测试了目标化合物的抗CMV活性，从表6生物活性测定结果可以看出含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物对CMV均具有中等到优秀的抑制活性，其中I2在治疗、保护、钝化方面，均优于对照药剂宁南霉素。为了进一步研究含4-哌啶基-6-甲基嘧啶杂环的氨基酸酯类化合物抗CMV活性，我们测定了该类化合物中I2的治疗EC50值，结果见表7。表7部分目标化合物对CMV的治疗活性的EC50值化合物EC50(μg/mL)I2213.2±1.9宁南霉素298.5±2.7结果可以看出，I2对CMV保护活性的EC50为213.2μg/mL，优于对照药剂宁南霉素298.5μg/mL。实施例10、烟草青枯病的测试方法：被测试化合物的浓度分别为100和200ug/mL，DMSO溶解在培养基中作为空白对照，噻菌铜为对照药剂，将烟草青枯病原菌在NA固体培养基上进行划线培养，放置在30℃恒温培养箱中培养，直到长出单菌落。用接菌环选取中央粉红色、白边较多的单菌落，放到NB液体培养基中，在30℃、180rpm恒温摇床中振荡培养到对数生长期备用。将化合物和对照药剂分别配置成浓度100和200ug/mL的含毒NB液体培养基5mL加入到试管中，加入40uL含烟草青枯病原菌的NB液体培养基中，在30℃、180rpm恒温摇床中振荡培养48h，将各个浓度的菌液在分光光度计上测定OD595值，并且另外测定对应浓度的含毒无菌NB液体培养基OD595值。校正OD值＝含菌培养基OD值—无菌培养基OD值抑制率％＝[(校正后对照培养基菌液OD值-校正含毒培养基OD值)/校正后对照培养基菌液OD值]X100％。从上表可以看出：在测试浓度下，目标化合物对烟草青枯病病原菌具有一定的抑制活性，其中化合物I2，在200和100ug/mL浓度下对烟草青枯菌的抑制率为100％与商品化对照药剂噻菌铜相当。实施例10、利用MCT微反应器连续制备I2。取500mL的0.1mol/L的2-氨基-4-哌啶基-6-甲基嘧啶的甲苯溶液置于A瓶中(标为A瓶)，取500mL的浓度均为0.1mol/L的对甲氧基苯甲醛和丙二酸二乙酯的混合甲苯溶液置于B瓶中；将A瓶和B瓶分别用MPK2005中压恒流泵以10mL/min的流速推动，进入MCT微反应器(MCT微反应器设置反应温度90℃)，50分钟后停止反应，减压回收产物收集瓶中的对二甲苯，产物经柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1V/V)得34.5g目标产物I2，产率：90.0％。利用MCT微反应器可连续高收率生产克级目标产物I2。本发明实施例辅以说明本发明的技术方案。本发明效果是合成路线简单、产率较高，得到新型、高效的防治黄瓜花叶病毒病和烟草青枯病菌和的新药剂。当前第1页1 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