一株酰基高丝氨酸内酯降解菌及其在病害防治中的应用的制作方法

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一株酰基高丝氨酸内酯降解菌及其在病害防治中的应用。

背景技术：

微生物通过监测胞外信号分子(自诱导剂)的浓度来感知群体密度的变化，当其达到某一阈值时，启动目标基因的表达，协调群体行为，即群体感应(quorumsensing,qs)(whiteleym,digglesp,greenbergep.progressinandpromiseofbacterialquorumsensingresearch[j].nature.2017,551(7680):313-320.)。群体感应广泛存在于微生物群体中，并与微生物多种生物功能有关，如：生物发光、共生现象、生物膜形成、抗生素合成、群体移动性、质粒转移、孢子形成、基因交换等(daviesdg,parsekmr,pearsonjp,etal.theinvolvementofcell-to-cellsignalsinthedevelopmentofabacterialbiofilm[j].science,1998,280(5361):295-298.)。

其中，酰基高丝氨酸内酯类物质(n-acylhomoserinelactones，ahls)是革兰氏阴性菌特有的群体感应信号，该类物质大都具有相同的高丝氨酸内酯环状的结构，且都具有酰基侧链，但其酰基侧链长度、饱和度存在差异。比如常见的n-(3-oxododecanoyl)-l-homoserinelactone(oddhl)和n-(3-oxohexanoyl)-l-homoserinelactone(ohhl)均属于ahls，其差别在于酰基侧链长度不同。ahls信号广泛存在于革兰氏阴性菌中，包括植物致病菌欧文氏菌(erwinia)、迪卡氏菌(dickeya)、人体致病菌绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)等，并与致病菌致病性相关，如：ohhl为植物致病菌dickeyazeaeec1的群体感应信号分子，且其介导的群体感应现象并与其致病性有关(hussainmb,zhanghb,xujl,etal.theacyl-homoserinelactone-typequorum-sensingsystemmodulatescellmotilityandvirulenceoferwiniachrysanthemipv.zeae[j].journalofbiotechnology,2008,190(3):1045-1053.)、oddhl为人体致病菌绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)的群体感应信号分子，且其介导的群体感应系统与生物膜的形成关系密切(huangjj,hanji,zhanglh,etal.utilizationofacyl-homoserinelactonequorumsignalsforgrowthbyasoilpseudomonadandpseudomonasaeruginosapao1[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2003,69(10):5941-5949.)。

群体感应淬灭(quorumquenching,qq)即通过抑制信号分子的合成、积累、监测、或对信号分子进行酶降解或修饰的机制来干扰群体感应系统(fetzners.quorumquenchingenzymes[j].journalofbiotechnology,2015,201:2-14.)。研究发现，通过群体感应淬灭的方法来防治病害，对病原菌不产生选择压力使病原菌不易产生抗药性。群体感应淬灭是有效防治植物细菌病害的新途径，具有操作简便、经济实用、环境友好、效率高且周期短等优点。针对不同群体感应信号发展群体淬灭制剂是目前国际范围的研究热点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有植物病原菌防治技术的缺陷和不足，提供一种具有高效降解群体感应信号分子ahls信号、ahls信号类似物的菌株及其作为生防菌的用途。

本发明的目的是提供一株可降解ahls群体感应信号分子的不动杆菌(acinetobacterschindleri)菌株xj-10。

本发明另一目的是提供所述不动杆菌在防治依赖ahls介导致病的植物病害中的应用。

本发明再一目的是提供一种防治依赖ahls致病的致病菌病害的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株可降解ahls群体感应信号分子的不动杆菌(acinetobacterschindleri)菌株xj-10，该菌株已于2017年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2017650，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

该菌株从采集自新疆的土壤样本，经人工筛选分离纯化获得，经过对该菌株的形态学特征、生理生化特性及16srdna系统发育分析，鉴定该菌株为不动杆菌(acinetobacterschindleri)，并命名为xj-10。

同时对该菌株xj-10进行了不同抗生素敏感性分析。该菌株xj-10对氨苄青霉素的抗性达到400μg/ml以上，卡那霉素的抗性达到200μg/ml，庆大霉素的抗性达到100μg/ml，对链霉素、氯霉素的抗性均达到20μg/ml。

本发明提供的不动杆菌(acinetobacterschindleri)菌株xj-10可以快速降解群体感应信号分子ahls。不动杆菌可以降解革兰氏阴性菌群体感应信号，尤其是欧文氏菌(erwinia)、迪卡氏菌(dickeya)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)等微生物类群群体感应信号。这些革兰氏阴性类群的致病菌的信号分子均为高丝氨酸内酯类物质。

在降解群体感应信号分子的应用中，经过试验研究显示，不动杆菌(acinetobacterschindleri)菌株xj-10对群体感应信号分子ahls有显著且快速的降解作用。可以在以oddhl为唯一碳源的培养基中正常生长，在48h内能将初始浓度为0.2mm的群体感应信号分子oddhl完全分解。同时，该菌株对群体感应信号分子ohhl也具有较好的降解效果。在防治ahls介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。

因此，不动杆菌在降解群体感应信号分子ahls和/或ahls信号类似物中的应用，或在制备降解ahls和/或ahls信号类似物的产品中的应用；在防治依赖ahls介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖ahls致病的致病菌的防治制剂方面的应用；均应在本发明的保护范围之内。

具体地，所述ahls信号类物质为高丝氨酸内酯类物质。包括oddhl和ohhl等。

优选地，所述不动杆菌为上述不动杆菌菌株xj-10。

另外，基于上述应用，本发明提供的不动杆菌(acinetobacterschindleri)菌株xj-10具有生物防治的发展潜力。

本发明还提供了一种防治依赖ahls致病的致病菌病害的方法，具体是用不动杆菌的菌悬液对作物进行处理。所述处理的方式为接种或喷雾处理。

优选地，所述不动杆菌为上述不动杆菌菌株xj-10。

其中，所述依赖ahls致病的致病菌包括：迪卡氏菌(dickeya)、欧文氏菌(erwinia)或绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)等；不动杆菌菌株xj-10对这些依赖ahls致病的致病菌的病害具有显著的生防作用。

优选地，制备菌株xj-10菌悬液的最适培养基为富营养培养基，其配方为：胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，氯化钠10.0g/l，ph6.8～7.2，121℃灭菌15～25min。

另外，一种含有菌株xj-10和/或其菌悬液的可降解群体感应信号分子ahls的降解菌剂，以及一种含有菌株xj-10和/或其菌悬液的依赖ahls致病的致病菌的生防制剂，也都应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现，不动杆菌针对群体感应信号分子ahls具有较好的降解活性，且降解效果稳定显著且快速，为ahls介导致病的致病菌的防治提供了一种新的途径和方法。

同时，本发明还提供了一株对群体感应信号分子的具有显著的快速降解活性的不动杆菌菌株xj-10，在防治ahls介导致病的致病菌方面有巨大的应用潜力，这为以生物防治替代化学防治且以阻断群体感应为靶标而不引起选择压力的治疗策略提供了新的开发途径。

附图说明

图1为本发明的菌株xj-10在lb培养基上的菌落形态图。

图2为本发明的菌株xj-10在血平板培养基上的菌落形态图。

图3为本发明的菌株xj-10的扫描电镜图。

图4为本发明的菌株xj-10的系统进化树分析图。

图5为本发明的菌株xj-10在不同抗生素中的生长情况图。

图6为本发明的菌株xj-10的降解活性测定图。

图7为本发明的菌株xj-10对oddhl降解的hplc图(图a为未接种菌株xj-10的对照图，图b、c分别为菌株xj-10对oddhl12h，24h的降解高效液相色谱图)。

图8为本发明的菌株xj-10、dh5α、b23、ec1分别单独接种及分别与ec1共同接种接种于马铃薯块茎30h后的发病情况。

图9为本发明的菌株xj-10、3937分别单独接种及共同接种于白菜梗24h后的发病情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用到的材料如下：

lb培养基：胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，氯化钠10.0g/l，ph6.8～7.2，121℃灭菌15～25min。lb固体培养基配方是在液体培养基中加入1.5％(w/ν)的琼脂。

基础盐培养基(msm)：(nh4)2so4，2.0g/l；cacl2·2h2o，0.01g/l；na2hpo4·12h2o，1.5g/l；kh2po4，1.5g/l；mgso4·7h2o，0.2g/l；feso4·7h2o，0.001g/l；ph6.5。

基础培养基(mm)：k2hpo4，10.5g/l；kh2po4，4.5g/l；(nh4)2so4，2.0g/l；mannitol，2.0g/l；glycerol，2.0g/l；mgso4·7h2o，0.2g/l；cacl2，0.01g/l；

feso4，0.005g/l；mncl2，0.002g/l；ph6.5。

oddhl、ohhl采购自上海有德化工科技有限公司，x-gal、培养基所需试剂均采购自广州齐湘、华奇盛等公司。

实施例1oddhl降解菌(不动杆菌菌株xj-10)的分离、筛选

1、不动杆菌菌株xj-10的分离与筛选

(1)土样采集：采集自新疆的土壤样本作为微生物源。

土样于2014年10月9日采集自新疆省农田，进行取样、装袋、保存作为微生物源带回实验室进行菌株的分离与筛选。

(2)菌株的富集培养：制备基础盐培养基(msm)，在250ml三角瓶内装入50ml的msm培养基，121℃灭菌15～25min，冷却后在无菌条件下加入oddhl母液(溶剂为甲醇)，使oddhl最终浓度为5μm，除此之外加入土样5g，放置于30℃、200rpm摇床培养7d后，按10％的接种量转接到oddhl浓度为10μm的msm培养基中。相同条件培养7d后，再按10％的接种量转接到oddhl浓度为20μm的msm培养基中，再以相同条件培养7d。以此类推，不断增加oddhl的浓度。

(3)菌株分离：采用平板涂布法进行菌株的分离。

取1ml终msm培养基发酵液，用无菌水将其稀释成浓度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的发酵液，然后分别吸取各个浓度的发酵液100μl，在lb固体平板上涂布均匀、晾干，30℃培养24h。挑取平板上长出的不同形态的单菌落，在lb固体平板反复划线培养纯化，直至分离出单菌株。用甘油保种法将单菌株保存于-80℃，待进一步实验检测降解活性。

(4)菌株筛选：利用报告菌株(agrobacteriumtumefaciensnt1)筛选具有降解活性的菌株。

将待筛选的菌株从-80℃活化，划线于lb固体培养基平板上，在30℃培养箱培养24h。挑取单菌落，接种至lb液体培养基，以30℃，200rpm的条件过夜培养，得到菌液。取1个od600值的菌体，用1ml以oddhl为唯一碳源的msm培养基重悬，得到待培养的混合物，msm培养基中oddhl的浓度为20μm。将待培养的混合物转移至2ml离心管中，以30℃，200rpm的条件培养24h。24h后，取5μl反应混合物点样至涂布有200μl报告菌株菌液的mm板上，其中报告菌株菌液的od600＝0.4，mm板中含有浓度为40μg/ml的x-gal。将已经点有样本的mm板放置于28℃培养箱，24h后观察实验结果。

结果分析，oddhl具有扩散性，反应混合物中含有的oddhl越多，自样本点为中心向四周扩散的距离越远，则mm板上出现的蓝圈半径越大，与ck实验组对比，两者蓝圈半径越相近则说明该菌株对oddhl降解越弱或者无降解效果，反之，反应混合物中含有的oddhl越少，则产生的蓝圈直径越小甚至没有蓝圈的出现。根据实验结果筛选出对oddhl降解效果最好的菌株，命名为降解菌xj-10。

实施例2不动杆菌菌株xj-10的鉴定

本实施例针对降解菌xj-10进行了形态学特征、生理生化特性及16srdna系统发育分析，鉴定该菌株为不动杆菌(acinetobacterschindleri)。具体如下：

(1)菌落形态特征：在lb固体平板上培养48h，菌落扁平，表面光滑不透明，边缘整齐，如图1所示；在血平板上该细菌菌落呈现米白色，如图2所示；在lb液体培养基中呈扩散性混浊，好氧，30℃下生长良好。

(2)菌体形态特征：如图3所示，菌体呈杆状，有时近球形，具有1根极生鞭毛。

(3)生理生化特性：该菌株为革兰氏阴性菌，好氧，接触酶试验反应阳性，氧化酶、溶血试验、明胶液化、淀粉水解试验反应阴性；可生长温度范围为20～41℃，最适生长温度为30℃，最适ph为7.0。其生理生化鉴定结果如表1和表2所示。

(4)16srdna序列及系统进化分析：菌株xj-10的16srdna基因序列长度为1420bp，与ncbi数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对后发现，菌株xj-10与acinetobacterschindleri具有较高的同源性，其系统进化树如图4所示。

综上所述，经过对菌株xj-10的形态学特征、生理生化特性及16srdna基因序列的鉴定及分析，鉴定该菌株属于不动杆菌(acinetobacterschindleri)，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2017650，保藏地址是中国武汉，武汉大学。

表1菌株xj-10生理生化鉴定结果

注：－：阴性反应；+：阳性反应。

表2菌株xj-10碳源利用鉴定结果

注：“－”表示为阴性反应或不利用；“+”表示阳性反应或利用

实施例3菌株xj-10的抗生素敏感性分析

为了能够更好地研究菌株xj-10，本实施例对菌株xj-10进行了多种抗生素敏感性检测。

实验结果分析：如图5所示，该菌株xj-10对氨苄青霉素的抗性达到400μg/ml及以上，对卡那霉素的抗性达到200μg/ml，对庆大霉素的抗性达到100μg/ml，对链霉素、氯霉素的抗性均达到20μg/ml。这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考。

实施例4菌株xj-10降解oddhl的活性检测

本实施例利用报告菌株(agrobacteriumtumefaciensnt1)检测菌株xj-10对oddhl的降解效果。

1、实验步骤：

用lb固体培养基平板活化菌株xj-10，将平板置于30℃培养箱，过夜培养。挑取单菌落接种至液体lb培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养得到菌液。取1个od600值的菌体，吸取1ml的以oddhl作为唯一碳源的msm培养基重悬菌体得到待反应混合物，其中msm培养基中oddhl的浓度为80μm。将反应混合物转移至2ml离心管中，以30℃，200rpm的条件培养24h。24h后，取5μl反应混合物点至琼脂条顶端，然后在下方依次点报告菌株(agrobacteriumtumefaciensnt1)菌液。然后将已经点好反应混合物和报告菌株的琼脂条放置于28℃培养箱，培养24h后观察实验结果。其中，琼脂条为含有浓度为40μg/mlx-gal的mm板切条所得。

escherichiacolidh5α为已知对oddhl无降解效果的菌株，在本实施例中为阴性对照组；苏云金芽孢杆菌以色列亚种(bacillusthuringiensissubsp.israelensis)b23为已知对oddhl具有降解效果的菌株，在本实施例中为阳性对照(dongy,xuj,lix,etal.aiia,anenzymethatinactivatestheacylhomoserinelactonequorum-sensingsignalandattenuatesthevirulenceoferwiniacarotovora[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences,2000,97(7):3526-3531.)；ck为不含菌体的空白对照。

2、结果分析：

实验结果如图6所示，ck和dh5α实验组自琼脂条顶端至报告菌株最后一个变蓝的点距离基本一致，说明这两个实验组反应混合物中oddhl的含量相近，与dh5α不具有降解oddhl能力的事实相符。b23和xj-10实验组报告菌株均未变蓝，说明这两个实验组的反应混合物中不含有oddhl，oddhl已经完全被降解，即xj-10能够降解oddhl。

实施例5利用hplc检测菌株xj-10降解oddhl的活性

1、步骤：将冻存于-80℃的菌株xj-10用lb固体板活化，30℃培养24h后挑取平板上的单菌落接种于液体lb培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养得到菌液。取1个od值的菌体，菌体用1ml的msm培养基重悬，将重悬液加入19mlmsm基础培养基中，并添加oddhl母液(溶剂为甲醇)，使其最终浓度为0.2mm。在30℃，200rpm的条件下培养，于0h、12h和24h三个时间点取样，并将样品中残余的oddhl提取出来，利用hplc测定oddhl的残留量表示菌株xj-10对oddhl的降解情况。

2、样品中oddhl的提取方法：取适量样品至15ml离心管中，以4000rpm的速度离心5min后，取5ml上清液至50ml分液漏斗中，并向分液漏斗中加入等体积的乙酸乙酯，剧烈震荡3min后，静置，分层，将下层溶液转移至15ml离心管中，上层液经漏斗过滤到50ml圆底烧瓶中，漏斗中铺有滤纸。下层溶液按上述方法再进行1次萃取。滤液并入圆底烧瓶，45℃恒温旋转蒸发至干燥，用色谱甲醇分2次洗涤圆底烧瓶，定容至2ml，经0.45μm有机滤膜过滤至进样瓶，使用hplc法测定其残余量。

3、hplc测定oddhl残余量方法：

hplc仪器型号：waters2695。色谱柱：c18反相色谱柱(250μm×4.6mm×5μm)。流速为0.8ml/min。柱温为30℃。流动相：甲醇：水＝70；30(v：v)。检测波长为210nm。进样量为20μl。

4、oddhl降解率计算方法：降解率(％)＝(1-a1/a0)×100，a1为降解菌处理后oddhl残留浓度，a0为对照处理后的oddhl残留浓度。

5、实验结果分析：

hplc检测结果如图7所示，图a为未接种菌株xj-10的对照图，图b、c分别为菌株xj-10对oddhl12h，24h的降解图，降解率分别达到85.71％，98.8％，对应时间菌株xj-10的od600值分别为0.144，0.233。实验表明，在oddhl以唯一碳源存在的条件下，菌株能够快速降解oddhl并利用其生长。

实施例6菌株xj-10对马铃薯软腐病的的生防效果研究

本实施例以植物软腐病致病菌dickeyazeaeec1(hussainmb,zhanghb,xujl,etal.theacyl-homoserinelactone-typequorum-sensingsystemmodulatescellmotilityandvirulenceoferwiniachrysanthemipv.zeae[j].journalofbiotechnology,2008,190(3):1045-1053.)为例，研究菌株xj-10对依赖ahls致病的致病菌的生防效果。

1、步骤：

用lb固体培养基平板活化菌株xj-10与ec1，30℃培养24h。24h后分别挑取平板上的单菌落，接种至液体lb培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养。分别设置七个实验组：xj-10+lb，dh5α+lb，b23+lb，ec1+lb，xj-10+ec1，dh5α+ec1，b23+ec1。

其中，escherichiacolidh5α为已知对oddhl无降解效果的菌株，在本实施例中为阴性对照组。苏云金芽孢杆菌以色列亚种(bacillusthuringiensissubsp.israelensis)b23为已知对oddhl具有降解效果的菌株，在本实施例中为阳性对照。实验中，xj-10、dh5α、b23、ec1最终工作液od600＝1.0。每个实验组用移液枪接种5μl的混合菌液至马铃薯切片中央。

2、结果分析：

如图8所示，xj-10+lb，dh5α+lb，b23+lb三个实验组的马铃薯未发病，说明xj-10、dh5α、b23对马铃薯无致病性；ec1、dh5α+ec1，b23+ec1三个实验组马铃薯发病情况并未有明显差异。实验组xj-10+ec1的马铃薯发病严重程度明显较ec1、dh5α+ec1，b23+ec1三个试验组发病严重程度轻。实验结果表明，菌株xj-10对dickeyazeaeec1引起的软腐病具有显著的生防效果。

实施例7菌株xj-10对白菜软腐病的的生防效果研究

本实施例以引能够引发白菜软腐病的病原菌dickeyadadantii3937(glasnerjd,yangc,reverchons,etal.genomesequenceoftheplant-pathogenicbacteriumdickeyadadantii3937[j].journalofbiotechnology,2011,193(8):2076-2077.)为例，研究菌株xj-10对依赖ahls致病的病原菌的生防效果。

1、步骤：

用lb固体培养基平板活化菌株xj-10与3937，30℃培养24h。24h后分别挑取平板上的单菌落，接种至液体lb培养基中，以30℃，200rpm的条件过夜培养。分别设置lb，3937，xj-10，xj-10+3937，四个实验组，使3937、xj-10最终工作浓度od600＝1.0。每个实验组用移液枪接种2μl的混合菌液至白菜梗。24h后观察发病情况。

2、结果分析：

如图9所示，在已接种并培养24h的白菜梗上可以看到，lb，xj-10两个实验组的接种处未发病，说明lb，xj-10对白菜梗无致病性。相对于实验组3937接种处，实验组xj-10+3937的接种处无明显软腐症状出现，发病程度较轻。实验结果表明，菌株xj-10对dickeyadadantii3937引起的软腐病具有显著的生防效果。