本发明涉及微生物工程技术领域，且特别涉及一种丁酸梭菌发酵产物以及丁酸梭菌固态发酵方法。
背景技术：
固态发酵是指在几乎不存在游离水的条件下微生物利用天然物质作为碳源和能源的发酵工艺。进入21世纪后，能源危机与环境问题日益突出，固态发酵技术再次引起人们的注意，固态发酵领域的研究也有长足进步。目前为止，已有上千篇论文在国内外的期刊上发表。
目前，固态发酵在很多领域都有研究和应用，主要应用在以下领域：抗生素和生物活性物质、酶制剂、有机酸及益生菌的制备。固态发酵和液态深层发酵是两种完全不同的发酵方式，目前液态深层发酵技术比较成熟，但由于设备的投入大、技术要求高，从而限制了其在某些领域的应用。固态发酵制备动物益生菌制剂的研究与应用也越来越广泛，与液态发酵相比优势明显：固态发酵设备简单、投资少、操作方便。
丁酸梭菌为典型的严格厌氧菌。最适生长温度在25-37℃，最适ph值为4.0～9.8。在液体培养基中培养，培养初期试管上部呈轻微浑浊，产大量的气体，后期沉淀较多。丁酸梭菌在平板上菌落呈圆形，边缘整齐，侧面低凸，表面湿润光滑，乳黄色，不透明，略有酸臭味。丁酸梭菌不能水解酪蛋白和明胶。不分解蛋白质，不产生氨、吲哚、硫化氢等物质，能利用蔗糖、葡萄糖、淀粉纤维素；不能利用卫毛醇、山梨醇；发酵产物主要有丁酸、乙酸、丁醇、乙醇、甲酸、h2、co2、丙二醇等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌固态发酵方法，此丁酸梭菌固态发酵方法通过种子培养基的选择与优化，缩短培养时间，增加菌体浓度与菌体稳定性。同时，丁酸梭菌固态发酵培养基的成分的选择与优化，获得一种廉价的培养基配方和发酵工艺路线。
本发明的另一目的在于提供一种丁酸梭菌发酵产物，通过上述的丁酸梭菌固态发酵方法发酵后得到。此丁酸梭菌发酵产物的培养时间，菌体浓度与菌体稳定性强。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种丁酸梭菌固态发酵方法，其包括：
将粉碎后的豆粕、麦麸以及玉米粉过筛后混合得到第一混合物；
将第一混合物与50～100u/g的碱性蛋白酶、30～80u/g的中性蛋白酶、10～60u/g的α-淀粉酶混匀后在20～50℃下静置10～40h，酶解后得到备用的第二混合物；
将丁酸梭菌种子与10～100u/g的葡萄糖氧化酶及0.5～10％的葡萄糖混匀后装入厌氧发酵罐中，在20～60℃下静置培养1～5d得到第三混合物；
将第三混合物按照1～45％的比例接种到第二混合物得到第四混合物。
本发明提出一种丁酸梭菌发酵产物，此丁酸梭菌发酵产物通过上述的丁酸梭菌固态发酵方法发酵得到。
本发明实施例的一种丁酸梭菌发酵产物及其固态发酵方法的有益效果是：
此丁酸梭菌固态发酵方法通过种子培养基的选择与优化，缩短培养时间，增加菌体浓度与菌体稳定性。同时，丁酸梭菌固态发酵培养基的成分的选择与优化，获得一种廉价的培养基配方和发酵工艺路线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的丁酸梭菌发酵产物以及丁酸梭菌固态发酵方法进行具体说明。
s1:将粉碎后的豆粕、麦麸以及玉米粉过筛后混合得到第一混合物；其中，过筛是经40～100目过筛，在本发明的其他实施例中，过筛的目数还可以根据需求进行选择，本发明不做限定。
s2:将第一混合物与50～100u/g的碱性蛋白酶、30～80u/g的中性蛋白酶、10～60u/g的α-淀粉酶混匀后在20～50℃下静置10～40h，酶解后得到备用的第二混合物；当然，在本发明的其他实施例中，放置的温度以及静置的时间还可以根据需求进行相应地调整，本发明不做限定。
其中，碱性蛋白酶能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。α-淀粉酶以链淀粉为底物时，反应一般按两阶段进行。首先，链淀粉快速地降解，产生低聚糖，此阶段链淀粉的黏度及与碘发生呈色反应的能力迅速下降。第二阶段的反应比第一阶段慢很多，包括低聚糖缓慢水解生成最终产物葡萄糖和麦芽糖。α-淀粉酶作用于支淀粉时产生葡萄糖、麦芽糖和一系列限制糊精(由4个或更多个葡萄糖基构成低聚糖)，后者都含有α-1，6-糖苷键。
s3:将丁酸梭菌种子与10～100u/g的葡萄糖氧化酶及0.5～10％的葡萄糖混匀后装入厌氧发酵罐中，在20～60℃下静置培养1～5d得到第三混合物。
由于丁酸梭菌的生长环境需要严格厌氧，往培养好的种子液中加入10～100u/g的葡萄糖氧化酶向种子液中添加10～100u/g的葡萄糖氧化酶及0.5～10％的葡萄糖，可以在发酵过程中除去发酵底料中的氧气，避免了丁酸梭菌因氧气进入发酵罐而死亡。
s4:将第三混合物按照1～45％的比例接种到第二混合物得到第四混合物。经测定，通过此种方法发酵结束后，丁酸梭菌含量达到20亿cfu/g，丁酸含量3％，芽胞率达到80％。
作为优选的方案，是将粉碎后的按照重量份数计的500～800份的豆粕、50～200份的麦麸以及150～300份的玉米粉过筛后混合得到第一混合物。当然，在本发明的其他实施例中，各原料的具体用量还可以根据需求进行选择，本发明不做限定。
将第一混合物与按照重量份数计的0.1～5份的碱性蛋白酶、0.1～6份的中性蛋白酶、0.2～7份的α-淀粉酶以及100～800份的水混匀后在20～50℃下静置10～40h，酶解后得到备用的第二混合物。当然，在本发明的其他实施例中，各原料的具体用量还可以根据需求进行选择，本发明不做限定。
进一步地，在本发明的实施例中，丁酸梭菌固态发酵方法还包括将第二混合物在40～100℃的温度下烘干。烘干作业可以去除部分多于的水分。
需要说明的是，丁酸梭菌固态发酵方法还包括：
在将丁酸梭菌种子与10～100u/g的葡萄糖氧化酶及0.5～10％的葡萄糖混匀之前，通过试验从多种原始种子培养基中筛选出一种丁酸梭菌生长活菌数最多的培养基作为备用种子培养基，并且将丁酸梭菌菌种管热处理1～18min，按照1～45％的比例接种到备用种子培养基中，且在20～45℃下培养10～48h后灭菌冷却至室温得到将丁酸梭菌种子以备用。
其中，原始种子培养基包括第一培养基、第二培养基以及第三培养基；当然，在本发明的其他实施例中，原始培养基的个数还可以根据需求进行选择，本发明不做限定。
其中，第一培养基包括按照重量份数计的5～35份的胰蛋白胨，5～25份的牛肉膏，1～10份的酵母膏，1～10份的葡萄糖，0.1～5份的磷酸二氢钾，0.1～5份的氯化钙以及900～1100份的蒸馏水，优选的为1000份的蒸馏水。
具体地，第一培养基是将各组分混合后在ph为5～10，温度为110～120℃的环境下灭菌15～25min得到的。
其中，第二培养基包括按照重量份数计的1～15份的酵母浸膏、1～15份的牛肉浸膏、1～15份的胰蛋白胨、1～15份的葡萄糖、0.1～5份的可溶性淀粉、1～15份的氯化钠、1～15份的三水合乙酸钠、0.1～5份的半胱氨酸盐酸盐、0.1～5份的0.1％～5％美蓝以及900～1100份的蒸馏水，优选的为1000份的蒸馏水。
其中，第三培养基包括按照重量份数计的1～15份的酵母浸膏、1～15份的胰蛋白胨、1～15份的葡萄糖、0.1～5份的可溶性淀粉、1～15份的氯化钠，0.1～5份的半胱氨酸盐酸盐以及900～1100份的蒸馏水，优选的为1000份的蒸馏水。
第二培养基与第三培养基是将各自对应的各组分混合后在ph为5～9，温度为110～120℃的环境下灭菌15～25min得到的。
需要说明的是，在本发明中，经过筛选得到的备用种子培养基为第二培养基。当然，在本发明的其他实施例中，在不同条件状态下，筛选出的备用种子培养基的种类还可能为其他组分，本发明不做限定。
进一步地，在本发明的实施例中，丁酸梭菌固态发酵方法还包括调节选出的备用种子培养基的ph至5.5～7.5后在温度为110～120℃的环境下灭菌15～25min。当然，在本发明的其他实施例中，加热的温度与灭菌的时间也可以根据需求进行相应地调整，本发明不做限定。
进一步地，在本发明的实施例中，丁酸梭菌固态发酵方法还包括：
将第四混合物与重量比为1～30％的玉米淀粉和重量比为1～30％的柠檬酸三钠混匀后得到第五混合物。
并且，丁酸梭菌固态发酵方法还包括：将第五混合物在40～100℃下干燥1～10h，即为成品。
本发明的实施例还提供了一种丁酸梭菌发酵产物，此丁酸梭菌发酵产物通过上述的丁酸梭菌固态发酵方法发酵得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种丁酸梭菌发酵产物，此发酵产物通过以下的丁酸梭菌固态发酵方法发酵后得到：
s1：通过试验从多种原始种子培养基中筛选出一种丁酸梭菌生长活菌数最多的培养基作为备用种子培养基，并且将丁酸梭菌菌种管热处理1min，按照1％的比例接种到备用种子培养基中，且在20℃下培养10h后灭菌冷却至室温得到将丁酸梭菌种子以备用。
其中，原始种子培养基包括第一培养基、第二培养基以及第三培养基；
其中，第一培养基包括按照重量计的5g的胰蛋白胨，5g的牛肉膏，1g的酵母膏，1g的葡萄糖，0.1g的磷酸二氢钾，0.1g的氯化钙以及900ml的蒸馏水；第一培养基是将各组分混合后在ph为5，温度为110℃的环境下灭菌15min得到的；
其中，第二培养基包括按照重量计的1g的酵母浸膏、1g的牛肉浸膏、1g的胰蛋白胨、1g的葡萄糖、0.1g的可溶性淀粉、1g的氯化钠、1g的三水合乙酸钠、0.1g的半胱氨酸盐酸盐、0.1ml的0.1％美蓝以及900ml的蒸馏水；
其中，第三培养基包括按照重量计的1g的酵母浸膏、1g的胰蛋白胨、1g的葡萄糖、0.1g的可溶性淀粉、1g的氯化钠，0.1g的半胱氨酸盐酸盐以及900ml的蒸馏水。第二培养基与第三培养基是将各自对应的各组分混合后在ph为5，温度为110℃的环境下灭菌15min得到的。
s2：将粉碎后的按照重量计的500g的豆粕、50g的麦麸以及150g的玉米粉过筛后混合得到第一混合物；
s3：将第一混合物与按照重量计的0.1g的50u/g的碱性蛋白酶、0.1g的30u/g的中性蛋白酶、0.2g的10～60u/g的α-淀粉酶以及100ml的水混匀后在20℃下静置10h，酶解后得到备用的第二混合物，将第二混合物在40℃的温度下烘干；
s4：将丁酸梭菌种子与10u/g的葡萄糖氧化酶及0.5％的葡萄糖混匀后装入厌氧发酵罐中，在20℃下静置培养1d得到第三混合物；
s5：将第三混合物按照1％的比例接种到第二混合物得到第四混合物；
s6：将第四混合物与重量比为1％的玉米淀粉和重量比为1％的柠檬酸三钠混匀后得到第五混合物，将第五混合物在40℃下干燥1h，即为成品。
实施例2
本实施例提供了一种丁酸梭菌发酵产物，此发酵产物通过以下的丁酸梭菌固态发酵方法发酵后得到：
s1：通过试验从多种原始种子培养基中筛选出一种丁酸梭菌生长活菌数最多的培养基作为备用种子培养基，并且将丁酸梭菌菌种管热处理15min，按照25％的比例接种到备用种子培养基中，且在30℃下培养25h后灭菌冷却至室温得到将丁酸梭菌种子以备用。
其中，原始种子培养基包括第一培养基、第二培养基以及第三培养基；
其中，第一培养基包括按照重量计的10g的胰蛋白胨，10g的牛肉膏，2g的酵母膏，2g的葡萄糖，0.5g的磷酸二氢钾，0.2g的氯化钙以及1000ml蒸馏水；第一培养基是将各组分混合后在ph为6.5，温度为115℃的环境下灭菌20min得到的；
其中，第二培养基包括按照重量计的10g的酵母浸膏、10g的牛肉浸膏、10g的胰蛋白胨、10g的葡萄糖、1g的可溶性淀粉、10g的氯化钠、5g的三水合乙酸钠、2g的半胱氨酸盐酸盐、2ml的2％美蓝以及1100ml的蒸馏水；
其中，第三培养基包括按照重量计的10g的酵母浸膏、10g的胰蛋白胨、10g的葡萄糖、2g的可溶性淀粉、10g的氯化钠，2g的半胱氨酸盐酸盐以及1000ml的蒸馏水。第二培养基与第三培养基是将各自对应的各组分混合后在ph为6.5，温度为115℃的环境下灭菌20min得到的。
s2：将粉碎后的按照重量计的600g的豆粕、150g的麦麸以及170g的玉米粉过筛后混合得到第一混合物；
s3：将第一混合物与按照重量计的0.2g的碱性蛋白酶、0.4g的中性蛋白酶、5g的α-淀粉酶以及600ml的水混匀后在20～50℃下静置20h，酶解后得到备用的第二混合物，将第二混合物在50℃的温度下烘干；
s4：将丁酸梭菌种子与50u/g的葡萄糖氧化酶及5％的葡萄糖混匀后装入厌氧发酵罐中，在40℃下静置培养3d得到第三混合物；
s5：将第三混合物按照20％的比例接种到第二混合物得到第四混合物；
s6：将第四混合物与重量比为20％的玉米淀粉和重量比为20％的柠檬酸三钠混匀后得到第五混合物，将第五混合物在50℃下干燥5h，即为成品。
实施例3
本实施例提供了一种丁酸梭菌发酵产物，此发酵产物通过以下的丁酸梭菌固态发酵方法发酵后得到：
s1：通过试验从多种原始种子培养基中筛选出一种丁酸梭菌生长活菌数最多的培养基作为备用种子培养基，并且将丁酸梭菌菌种管热处理18min，按照45％的比例接种到备用种子培养基中，且在45℃下培养48h后灭菌冷却至室温得到将丁酸梭菌种子以备用。
其中，原始种子培养基包括第一培养基、第二培养基以及第三培养基；
其中，第一培养基包括按照重量计的35g的胰蛋白胨，25g的牛肉膏，10g的酵母膏，10g的葡萄糖，5g的磷酸二氢钾，5g的氯化钙以及1100ml的蒸馏水；第一培养基是将各组分混合后在ph为10，温度为120℃的环境下灭菌25min得到的；
其中，第二培养基包括按照重量计的15g的酵母浸膏、15g的牛肉浸膏、15g的胰蛋白胨、15g的葡萄糖、5g的可溶性淀粉、15g的氯化钠、15g的三水合乙酸钠、5g的半胱氨酸盐酸盐、5ml的5％美蓝以及1100ml的蒸馏水；
其中，第三培养基包括按照重量计的15g的酵母浸膏、15g的胰蛋白胨、15g的葡萄糖、5g的可溶性淀粉、15g的氯化钠，5g的半胱氨酸盐酸盐以及1100ml的蒸馏水。第二培养基与第三培养基是将各自对应的各组分混合后在ph为9，温度为120℃的环境下灭菌25min得到的。
s2：将粉碎后的按照重量计的800g的豆粕、200g的麦麸以及300g的玉米粉过筛后混合得到第一混合物；
s3：将第一混合物与按照重量计的5g的碱性蛋白酶、6g的中性蛋白酶、7g的α-淀粉酶以及800ml的水混匀后在50℃下静置40h，酶解后得到备用的第二混合物，将第二混合物在100℃的温度下烘干；
s4：将丁酸梭菌种子与100u/g的葡萄糖氧化酶及10％的葡萄糖混匀后装入厌氧发酵罐中，在60℃下静置培养5d得到第三混合物；
s5：将第三混合物按照45％的比例接种到第二混合物得到第四混合物；
s6：将第四混合物与重量比为30％的玉米淀粉和重量比为30％的柠檬酸三钠混匀后得到第五混合物，将第五混合物在100℃下干燥1～10h，即为成品。
实验例1
对实施例1至3提供的丁酸梭菌发酵产物中的活菌数，芽孢转化率以及丁酸产量进行测量。
测量结果显示活菌数达到10～30亿cfu/g，芽孢转化率达到50～90％，丁酸产量0.5～10％，与液体发酵对比，固态发酵在发酵设备、水电等方面的费用较低；在发酵料后处理中工艺简单，节省液体发酵中浓缩、喷雾干燥成本。
综上所述：此丁酸梭菌固态发酵方法通过种子培养基的选择与优化，缩短培养时间，增加菌体浓度与菌体稳定性。同时，丁酸梭菌固态发酵培养基的成分的选择与优化，获得一种廉价的培养基配方和发酵工艺路线。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。