一株高表达亚油酸异构酶LAI的罗伊乳杆菌HI120及其应用的制作方法

本发明属于微生态活菌制剂技术领域，具体涉及一株高表达亚油酸异构酶lai的罗伊乳杆菌hi120及其应用。

背景技术：

肥胖、高血脂、脂肪肝等脂代谢异常所致的疾病严重威胁人类健康。长期的脂代谢异常不可避免会引发高血脂、高血压和高血糖等“三高”疾病，是进一步引发心脑血管意外、肝硬化、糖尿病和恶性肿瘤等严重疾病的主要因素，对人体健康危害极大。

绝大多数的脂代谢异常都是由于不良的饮食结构和生活习惯所致，是能量的摄取和消耗不平衡造成的。其中，脂肪酸摄取过量和脂肪酸构成比例失调是最主要的因素。饮食中ω-6/ω-3脂肪酸(不饱和键位于甲基端第3/6碳原子上)的适当比例(5-8∶1)是保持身体健康的必要条件。ω-6脂肪酸摄入过多，或者ω-6/ω-3脂肪酸的比例失调都会导致脂代谢异常。动物油以饱和脂肪酸为主，长期食用容易引起肥胖等脂代谢异常。日常食用的植物油，如花生油、菜籽油、玉米油和豆油中，虽然以不饱和脂肪酸为主，但ω-6脂肪酸含量最多，ω-3脂肪酸含量极少。其中ω-6脂肪酸又以亚油酸(linoleicacid，la)含量最多，占总重量的35-70％，长期食用同样会引起肥胖等脂代谢异常。只有少数植物油，如亚麻籽油、紫苏油等含有一定量的ω-3脂肪酸α-亚麻酸(ala)。但这些植物油由于植物种植面积小、出油率低，来源有限。深海鱼油、海藻油中富含20-30％二十二碳六烯酸(dhac22:6)和二十碳五烯酸(epac20:5)等ω-3脂肪酸。但是，随着海洋资源的枯竭，深海鱼油来源有限，价格太高，也不能作为普通民众的常规食用油。

ω-6脂肪酸是炎症介质合成的原料，在体内主要通过引起长期慢性炎症导致脂代谢异常及并发症。ω-6脂肪酸在体内主要转化为花生四烯酸(aa)，aa是合成前列腺素e2(pge2)、血栓烷素a2(txa2)和白三烯b4(ltb4)等最强炎症介质的原料。pge2,lta4、ltb4和txa2、txb2是体内活性最强的炎症介质，参与动脉粥样硬化、血栓形成、胰岛损伤和炎症发生等病理变化，并且有刺激细胞增殖，诱发肿瘤的作用。

共轭亚油酸(cla)具有很强的减肥降脂、降糖抗炎等功能作用。共轭亚油酸(cla)是ω-6脂肪酸亚油酸(la)的同分异构体，与la结构相似，但功能作用却与la绝然相反。cla最初发现于牛奶中。反刍动物瘤胃中有些细菌，如溶纤维丁酸弧菌、埃氏巨球形菌有较高的la异构酶(lai)活性。la化学结构中的双键都是顺式的。lai可将la中一个顺式双键变构为反式双键，形成共轭双键亚油酸，即cla。最常见的cla存在形式是cis-9,trans-11c18:2(c9t11)和trans-10,cis-12c18:2(t10c12)。许多益生菌，如罗伊氏乳酸杆菌、乳酸乳球菌和短双歧杆菌，基因组中都有lai基因，但lai活性不高，变构la为cla的效率很低。

cla在体内可最后转化生成为pgd3、txa1/3、lta5和前列环素i3(pgi3)等化合物，这些化合物与炎症介质pge2、txa2和ltb4等的结构相似，但作用刚好相反，起竞争抑制炎症反应的作用。比如，pgi3有扩张血管、减少血小板凝集的作用，可抑制血栓形成，降低心脑血管意外的风险。

cla还可以与核受体结合，直接进入细胞核调节一些基因的表达来发挥减肥、降脂的功能作用。cla能与多种过氧化物酶体增殖子激活受体(ppar)结合，调控一系列基因的表达：(1)抑制脂肪细胞的脂蛋白脂酶(lipoproteinlipase)活性，阻止载脂蛋白b和a的降解，促进脂肪的转运和动员，抑制脂肪的合成，发挥降脂作用。(2)下调环氧化酶2(cyclooxygenase2，cox-2)的表达。cox-2是催化花生四烯酸(aa)向pge2转化的关键酶。下调cox-2表达可以抑制炎症反应。(3)上调一氧化氮合酶(inos)活性，促进pgf2α的生成，竞争抑制pge2的作用。(4)上调p53、p21、p27等抑癌基因和促凋亡蛋白bax表达，增强胱蛋白酶(caspase)3、9活性，下调周期素(cyclin)d、e和抗凋亡蛋白bcl-2的表达，抑制胰岛素样生长因子ⅱ(igf-ⅱ)的表达分泌。因而有抑制癌细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。研究发现，cla在体外能直接抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。

有研究显示，给肥胖(ob)小鼠喂食cla，可显著上调脂肪细胞pparγ表达，动员脂肪分解，改善胰岛素抵抗。临床试验显示，每天服用3-4g的混合cla，正常成人、肥胖患者和中老年人的脂肪含量都有一定程度下降，糖尿病患者血糖降低，胰岛素的敏感性得到改善。虽然cla早在2009年就被中国卫计委批准列入新食品名录。但是，化学合成或生物合成的cla价格昂贵，不能作为普通民众的常规食品或食品添加剂。

痤疮丙酸杆菌lai基因可将la变构为t10c12cla。研究显示，口服痤疮丙酸杆菌lai基因转化乳酸杆菌活菌可以显著改变小鼠脂肪组织和肝脏脂肪酸的组成，提高肠道和其他脂肪组织epa和dha等ω-3脂肪酸含量。但是，痤疮丙酸杆菌、溶纤维丁酸弧菌、埃氏巨球形菌等细菌是条件致病菌，还没有列入食用菌名录，活菌不能直接食用。而现有法规又不允许携带lai基因的重组乳酸菌作为功能食品上市。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株高表达亚油酸异构酶lai的罗伊乳杆菌hi120，该罗伊乳杆菌hi120的亚油酸异构酶(lai)的表达水平比罗伊乳杆菌标准菌和其他益生菌高，能在体内和体外将亚油酸(la)转化为共轭亚油酸(cla)。

本发明的目的还在于提供一种微生物活菌制剂，该微生物制剂含有上述罗伊乳杆菌hi120，将该菌制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉或菌片等活菌制剂，口服后能在人体肠道内增殖和富集，可将部分食物来源的la转化为cla。

本发明的最后一个目的在于提供上述微生物活菌制剂在制备具有预防和/或辅助治疗肥胖糖尿病功效以及具有预防和/或辅助治疗结肠直肠癌功效的食品添加剂、食品或药物中的应用。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一株高表达亚油酸异构酶lai的罗伊乳杆菌hi120，该菌株已于2016年11月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为gdmccno：60119。

该罗伊乳杆菌hi120分离自健康幼儿的粪便，亚油酸异构酶(lai)的表达水平比罗伊乳杆菌标准菌dsm20016(dsm)和长型双歧杆菌高6～10倍(如图2中所示)，能在体内和体外将亚油酸(la)转化为共轭亚油酸(cla)。

具体的，该罗伊乳杆菌hi120的分类命名为：lactobaccillusreuteri，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为：2016年11月21日，保藏编号为：gdmccno：60119。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种微生物活菌制剂，含有上述的高表达亚油酸异构酶lai的罗伊乳杆菌hi120。

该微生物活菌制剂可以为活菌悬液制剂、乳制品、活菌菌粉、冻干粉制剂、喷雾干燥肠溶活菌制剂、菌片等活菌制剂，口服后能在人体肠道内增殖和富集，可将部分食物来源的la转化为cla。

本发明的第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的微生物活菌制剂在制备具有预防和/或辅助治疗肥胖糖尿病功效以及具有预防和/或辅助治疗结肠直肠癌功效的食品添加剂、食品或药物中的应用。

该微生物活菌制剂可应用于肥胖糖尿病、肠道恶性肿瘤等疾病的预防与辅助治疗。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明中的罗伊乳杆菌hi120分离自健康幼儿的粪便，亚油酸异构酶(lai)的表达水平比罗伊乳杆菌标准菌(dsm20016)和其他益生菌高6～10倍，能在体内和体外将亚油酸(la)转化为共轭亚油酸(cla)；

(2)本发明将罗伊乳杆菌hi120制备成活菌悬液、乳制品、活菌菌粉或菌片等活菌制剂，口服后能在人体肠道内增殖和富集，可将部分食物来源的la转化为cla；

(3)本发明微生物活菌制剂应用于肥胖、高血脂、糖尿病、肠炎、恶性肿瘤(肠道肿瘤)及胃肠功能紊乱等疾病的预防与辅助治疗。

附图说明

图1是实施例1中罗伊乳杆菌hi120的分离和菌落特征，a：幼儿粪便中培养出的厌氧乳酸菌菌落；b：分离纯化后的hi120细菌菌落；c：hi120菌革兰氏染色的形态结构；

图2是实施例1中罗伊乳杆菌hi120与标准菌株体外将la变构为cla效率的比较，bfl：长双歧杆菌ncc2705，dsm：罗伊氏乳杆菌dsm20016，hi120：罗伊氏乳杆菌hi120；

图3是实施例1中罗伊乳杆菌hi120菌种16srrna序列与其他罗伊氏乳杆菌16srrna基因序列在美国ncbi数据库中blast比对结果；

图4是实施例1中gc-ms联用仪检测并鉴定hi120菌体外转化la为cla的化学性质，a：19种混合脂肪酸甲酯；b：hi120菌发酵产物甲基化产物；c：图b标注峰质谱分析图；

图5是实施例3中罗伊乳杆菌hi120菌活菌口服后对db糖尿病模型食量、体重及血脂的影响，a：hi120菌组与对照菌组小鼠食量的比较；b：hi120菌组与对照菌组小鼠体重的比较c：hi120菌组与对照菌组小鼠体重的外周血甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)浓度的比较，其中bc：空白对照；dsm：dsm20016标准菌株；hi120：hi120菌，下同；

图6是实施例3中罗伊乳杆菌hi120菌活菌口服后对db糖尿病模型小鼠血糖及口服糖耐量的影响，a：hi120菌组与对照菌组小鼠空腹血糖浓度的比较，b：hi120菌组与对照菌组小鼠口服葡萄糖后血糖变化的比较；

图7是实施例3中油红o染色显示罗伊乳杆菌hi120菌活菌口服对db糖尿病模型小鼠脂肪肝的影响，a：空白对照(bc)组；b：标准菌(dsm)处理组；c：hi120菌处理组；

图8是实施例4中hi120菌活菌口服对原发性结肠癌apc小鼠的治疗作用，左图：结肠癌模型小鼠，右图：hi120菌活菌防治结肠癌疗效。

具体实施方式

实施例1罗伊氏乳酸杆菌的分离和鉴定

1、罗伊氏乳酸杆菌菌株的分离

取健康幼儿新鲜粪便0.5g，置入9.5mlmrs培养基中，经过充分混匀后，稀释到100倍。取0.1ml涂布于mrs固体培养基，置厌氧培养箱37℃培养48h。挑选乳白色、中间隆起、周边圆整且发亮的菌落分别接种到mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，然后收集细菌进行cla转化实验，筛选亚油酸异构酶(lai)高活性菌株并进行菌种鉴定(图1)。

2、筛选高活性亚油酸异构酶(lai)菌株

分别将挑选的菌落和罗伊氏乳杆菌标准菌株dsm20016菌接种到含1mg/mltween-80的mrs培养基，细菌密度达到od6000.8时，分别加入la至1mg/ml，混悬振荡培养12小时。收集菌液离心取上清。1ml培养液+2ml异丙醇+1.5ml正己烷提取3min，经6000r/m离心5min，吸取上层正己烷层，静置分层，取上层正己烷层提取脂肪酸。采用紫外分光光度计在234nm波长测量样品的吸光度值，根据cla的标准曲线计算出菌液中的cla含量，以每毫升菌液中cla含量除以加入到每毫升菌液中的la总量，得到各菌株转化生成cla的效率。以标准菌株dsm20016菌作为对照。

图2中的结果显示，hi120菌株转化生成cla的平均效率分别比dsm20016菌(dsm)和长形双歧杆菌ncc2705(bfl)高6.1和9.1倍(图2)，所以，hi120菌比其他细菌转化生成cla的效率高6-9倍。

3、lai高活性菌株16srrna基因扩增和测序鉴定

收集菌液，加溶菌酶裂解细菌提取基因组dna。细菌16srrna通用引物7f、1540r为引物，以基因组dna为模板，pcr扩增16srna以菌液为模板，进行pcr反应，反应条件为：95℃预变性4min：每个循环的反应94℃45s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。pcr产物送上海生工公司进行测定鉴定。

4、序列比对与分析

在美国ncbi数据库，应用blast软件工具对hi120菌种16srrna基因序列与其他罗伊氏乳杆菌16srrna基因序列进行序列比对。

图3中的结果显示罗伊乳杆菌hi120菌种16srrna基因序列与罗伊氏乳杆菌标准菌株dsm20016及其他罗伊氏乳杆菌16srrna基因序列的同源性高达99％(图3)。

5、气相色谱-质谱(gc-ms)联用仪确定hi120菌转化生成的cla的主要化学结构

取脂肪酸提取物1ml，加入1mlhcl-甲醇(10％)，混匀后，80℃水浴1h。冷却至室温后，加入1ml三氟化硼甲醇混合液(bf3)混匀。50℃水浴10min。冷却后加入3ml正己烷，旋涡混匀，室温静置过夜，取正己烷层用于检测。气相色谱与质谱联用仪(gc-ms)检测条件：色谱柱db-5ms弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm0.5μm)；进样口温度250℃；分流进样，分流比例10.0；流速：1.0ml/min；载气为高纯度氦气(99.999％)；进样量1μl；溶剂延迟3min。质谱条件：四级杆温度为250℃；电离方式为电子轰击离子源(ei)；离子源温度为250℃；电子能量70ev；质量范围30-6000mau；扫描间隔0.2s/scan；电子倍增电压0.90kv。梯度升温程序：0～50min，60℃～300℃；速率:10℃/min；后运行温度300℃；后运行时间3min。根据19种脂肪酸甲酯标准品的色谱结果，结合质谱分析目的样品的洗脱峰，查看质谱数据中的样品中cla的结构形式。

图4中的结果显示，hi120菌将la转化生成主要化学结构为c9t11的cla(图4)。

实施例2微生物活菌制剂

1、活菌液的培养

用mrs培养基复苏罗伊乳杆菌hi120菌种，细菌达到一定浓度后，按一定比例(1:100-500)接种到mrs培养基中，等细菌密度达到od600为0.6-1.0时收集细菌。

2、活菌悬液的制备

细菌培养到一定密度后，5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌，加可食用糖盐混合溶液或饮料重悬，置4-8℃冰箱保存。

3、冻干活菌制剂的制备

细菌培养到一定密度后，5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌，按一定比例加防冻保护溶液(15％脱脂奶粉，5％甘油，0.9％nacl)重悬混合，分散均匀，放入超低温冰箱预冻至完全冻结，再放人冷冻干燥机，在真空度10.0-12.00pa条件下干燥至菌粉含水量<3％。冻干结束后，取出菌粉，分装到无菌密封容器中，-20℃保存待用。

4、喷雾干燥肠溶活菌制剂的制备

细菌培养到一定密度后，5000g-10000g离心5-10分钟收集细菌，加入肠溶性囊材和保护剂重悬，在一定的干燥温度100-120℃，风机频率50hz，液体流速20r/s的条件下喷雾干燥成肠溶性活菌菌粉。4-8℃冰箱保存备用。

5、hi120菌活菌菌粉细菌活力测定

称取0.1g菌粉，用1.0mlmrs培养基重悬，按1:100、1:1000、1:1000梯度稀释，分别取0.1ml菌液涂布于mrs固体培养基平板中，置厌氧培养箱37℃培养48h，计算每克菌粉落形成单位(cfu/g)。

实施例3生物活菌制剂在制备具有预防和/或辅助治疗肥胖糖尿病功效的食品添加剂、食品或药物中的应用

1、hi120活菌在防治db肥胖糖尿病中的应用

12只db小鼠随机分成2组：分别为口服dsm20016菌株组(dsm组)和口服hi120菌株组(hi120组)。dsm组和hi120组分别喂饲0.1ml(约6×109cfu)dsm20016和hi120菌粉。每日一次，小鼠共干预4周。隔天测量小鼠的食量和体重，每周测定空腹血糖，每两周检测口服葡萄糖耐量试验(ogtt)。4周后小鼠禁食12h，摘眼球取外周血后，断颈处死，取肝脏、胰腺、肠管及肠内容物。

2、小鼠的空腹血糖测定

分别在第一周、第二周、第三周、第四周，分别各组取6只小鼠，禁食12h以上，剪取鼠尾，用血糖仪测量其相应的空腹血糖值，并记录，用spss软件，对数据进行统计分析，并对数据的平均数与标准差进行绘图描述(图6)。

3、ogtt小鼠的普通糖耐量试验

在完成小鼠空腹血糖测定之后，称量小鼠的体重后，以2g/kg葡萄糖的标准，分别每组灌胃小鼠，在30min，60min，90min，120min后，剪取小鼠鼠尾，测量各组小鼠的血糖值，在0min，30min，60min，120min分别用血糖仪检测并记录小鼠的血糖值(图6)。用spss13.0统计软件计算出其曲线下的面积(auc)来反映胰岛素的敏感性。

图6中的结果表明，与空白对照(bc)和标准菌dsm20016(dsm)相比，罗伊乳杆菌hi120可显著降低小鼠空腹血糖，显著提高小鼠糖耐量。

4、血浆的生化检测

治疗一个月后，实验小鼠处理前禁食12h，摘眼球取血，2000rpm低温离心10min，取血浆保存于4℃冰箱。血浆甘油三脂(trig)和胆固醇(chol)含量等生化指标采用微量全自动生化检测仪进行检测，每个样品用双蒸水稀释3倍后上机测定(图5)。

图5中的结果表明，与空白对照(bc)和标准菌dsm20016(dsm)相比，罗伊乳杆菌hi120可显著降低小鼠食量、体重和血液中的甘油三酯trig和胆固醇chol的含量。

5、肝脏的油红o染色检测

取新鲜的肝脏组织或者-80℃冷冻的肝组织，置于液氮罐中，后包埋切片(10μm切片，防脱载玻片上粘附固定)，自然风干；蒸馏水浸洗，60％异丙醇浸洗2min；油红o染色10min(37℃温箱)；60％异丙醇调色25s(显微镜下观察颜色变化)；蒸馏水洗后苏木素复染1.5min；再用自来水冲洗返蓝；最后用明胶甘油封片(在封片前应将水性封固剂于60℃温水中加热至液状才可封片)，常规光学显微镜观察与拍照(图7)。

图7中的结果表明，与空白对照(bc)和标准菌dsm20016(dsm)相比，hi120可显著减轻小鼠脂肪肝，肝脏红色脂肪颗粒(油红o染色阳性)变小，结构更规则。

实施例4生物活菌制剂在制备具有预防和/或辅助治疗结肠直肠癌功效的食品添加剂、食品或药物中的应用

1、结直肠癌apc^min/+模型构建

(1)选择apc^min/+雄鼠与c57bl雌鼠，按每笼1只雄鼠三只雌鼠比例合笼。待产下乳鼠2周后，剪脚趾标记，剪取一小截尾巴或小片耳朵。常规方法提取组织基因组dna，按照南京模式动物资源库的方法，用聚合酶链反应(pcr)方法扩增目的dna片段，鉴定apc^min/+杂合子。pcr产物只有700bp条带为野生型小鼠；只有300bp条带为突变纯合子小鼠；同时有300bp和700bp条带即为apc^min/+杂合子小鼠。

(2)取6-8周apc^min/+雌雄造模，每只小鼠根据体重注射1mg/ml的aom，注射剂量为10μlaom/g。随后饲喂高脂饲料，观察小鼠状态和大便情况，每3天测量小鼠体重，待小鼠出现便血，甚至出现脱肛现象，则造模成功。

2、hi120活菌口服肠道途径防治原发性小鼠结肠癌

apc模型小鼠随机分成6组，每组最少6只。治疗实验选用造模成功的apc^min/+，治疗组喂饲0.1ml(约6×10⁹cfu)hi120菌粉悬液(hi120组)，每日喂饲一次；阴性对照组喂饲等量dsm20016菌菌粉(dsm组)。预防组选择未造模的apc^min/+杂合子小鼠，在喂饲hi120和dsm20016菌粉的同时进行结肠癌造模。隔天测量小鼠的食量和体重，注意观察小鼠状态和大便情况，等空白对照(bc)组小鼠出现便血脱肛严重，体重下降明显时处死小鼠。处死前禁食12h，摘眼球取外周血后，断颈处死，测量肠管的长度、注意观测肠管内瘤体的大小，同时探查小鼠肠系膜淋巴结，肝脏、肺部是否有转移灶，切取肠管组织和肠内容物保存备用(图8)。

图8中的结果表明，左图：结肠癌模型小鼠，可见腹腔内巨大大肠癌，四肢腋下淋巴结转移，伴肝、脾肿大。右图：hi120菌活菌防治结肠癌疗效，与空白对照(bc)和标准菌dsm20016(dsm)相比，hi120菌显著减少结肠癌瘤体的数量和大小，仅有的一个瘤体也已开始萎缩。

上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是上下具体实施例只用于对本发明作进一步的说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

序列表

<110>广州维生君生物科技有限公司

<120>一株高表达亚油酸异构酶lai的罗伊乳杆菌hi120及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1521

<212>dna

<213>罗伊乳杆菌(lactobaccillusreuteri)

<400>1

tcctggctcaggatgaacgccggcggtgtgcctaatacatgcaagtcgtacgcactggcc60

caactgattgatggtgcttgcacctgattgacgatggatcaccagtgagtggcggacggg120

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