蛋白质GmSCS06在调控植物抗逆性中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及蛋白质gmscs06在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术：
：在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，可以利用生物技术改进植物生长特性，进而提高植物对逆境的适应能力。在干旱和高盐等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质gmscs06在调控植物抗逆性中的应用。上述应用中，所述蛋白质gmscs06可为a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质。其中，序列表中序列2由367个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白质gmscs06的核酸分子在调控植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，编码所述蛋白质gmscs06的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质gmscs06的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质gmscs06的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由1511个核苷酸组成，序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增强植物抗逆性。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，包括向受体植物中导入提高所述蛋白质gmscs06表达和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的抗逆性提高。上述方法中，所述“向受体植物中导入提高所述蛋白质gmscs06表达和/或活性的物质”可通过向受体植物中导入编码所述蛋白质gmscs06的核酸分子实现。上述方法中，所述编码蛋白质gmscs06的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质gmscs06的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质gmscs06的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列1由1511个核苷酸组成，序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述方法中，所述“向受体植物中导入编码所述蛋白质gmscs06的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质gmscs06的核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pcambia2300-gmscs06。重组质粒pcambia2300-gmscs06具体可为将载体pcambia2300的限制性内切酶xmai和sali识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的dna分子。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。本发明所提供的植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质gmscs06的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述蛋白质gmscs06的含量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质gmscs06的含量和/或活性的效果。上述任一所述植物可为如下c1)至c5)的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥columbia。上述任一所述抗逆性可为抗盐性和/或抗旱性。上文中，所述抗盐性提高体现为高盐胁迫下株高增加和/或生物量增加和/或存活率提高。上文中，所述抗旱性提高体现为干旱胁迫下株高增加和/或生物量增加和/或存活率提高。上述任一所述方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，利用蛋白质gmscs06能增强植物的抗逆性：逆境(如高盐、干旱)胁迫下，与野生型拟南芥相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥株系的生长状态良好、株高显著增加、生物量显著增加、存活率显著提高。因此，蛋白质gmscs06在培育抗逆性增强的植物中具有重要的理论意义和实用价值。附图说明图1为抗盐性的鉴定结果。图2为抗旱性的鉴定结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。野生型拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)记载于如下文献中：kimh,hyuny,parkj,parkm,kimm,kimh,leem,moonj,leei,kimj.ageneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughfveinarabidopsisthaliana.naturegenetics.2004,36:167-171，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，以重复本申请实验。拟南芥(arabidopsisthaliana)(columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。大豆品种williams82由国家作物种质库提供。1/2霍格兰营养液记载于如下文献中：刘德高.过表达ibp5cr、iberd3、ibelt、ibnfu1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定.北京.2014年.中国农业大学博士毕业论文。光暗交替培养(即光照培养和黑暗培养交替)条件为：22℃；16h光照培养/8h黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μe/m2/s。实施例1、蛋白质gmscs06的编码基因的克隆1、采集正常生长2周的大豆品种williams82的幼嫩叶片，作为实验材料。2、取步骤1得到的实验材料，提取总rna，得到大豆的总rna。3、将大豆的总rna反转录出第一链cdna，得到大豆的cdna(浓度为500ng/μl)。4、以大豆的cdna为模板，以引物scs06f：5'-gtttgaggagccacttgtgg-3'和引物scs06r：5'-ttgccaccaactgcctaca-3'进行pcr扩增，得到约1.5kb的pcr扩增产物。反应体系为25μl，由2.5μl10×buffer(takara公司的产品)、1μldntp水溶液、2μl引物scs06f水溶液、2μl引物scs06r水溶液、1μl大豆的cdna(约20ng)、0.2μlextaq酶(约1u)和16.3μl去离子水组成；dntp在反应体系中的浓度为2.5mm，引物scs06f和引物scs06r在反应体系中的浓度均为5μm。反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸8min。对步骤4得到的pcr扩增产物进行测序。测序结果表明，pcr扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的dna分子为gmscs06基因，gmscs06基因编码序列表中序列2所示的蛋白质(以下命名为蛋白质gmscs06)。实施例2、转gmscs06基因拟南芥的获得和抗逆性鉴定一、重组质粒的构建1、采集正常生长2周的大豆品种williams82的幼嫩叶片，作为实验材料。2、取步骤1得到的实验材料，提取总rna，得到大豆的总rna。3、将大豆的总rna反转录出第一链cdna，得到大豆的cdna(浓度为500ng/μl)。4、以大豆的cdna为模板，以f1：5'-tcccgggatggggagtaagaaaaaaaatggtg-3'(下划线部分为限制性内切酶xmai的识别序列)和r1：5'-cggtcgacttatgctgtttcactagaagatggc-3'(下划线部分为限制性内切酶sali的识别序列)为引物进行pcr扩增，得到约1120bp的双链dna分子。5、用限制性内切酶xmai和sali双酶切步骤4中得到的双链dna分子，回收约1120bp的dna片段。6、用限制性内切酶xmai和sali双酶切载体pcambia2300，回收约12kb的载体骨架。7、将dna片段与载体骨架连接，得到重组质粒pcambia2300-gmscs06。将重组质粒pcambia2300-gmscs06进行测序。根据测序结果，对重组质粒pcambia2300-gmscs06进行结构描述如下：将载体pcambia2300的限制性内切酶xmai和sali识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第171至1274位所示的dna分子。重组质粒pcambia2300-gmscs06表达序列表中序列2所示的蛋白质gmscs06。二、农杆菌的获得1、将重组质粒pcambia2300-gmscs06导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/pcambia2300-gmscs06。2、将载体pcambia2300导入根癌农杆菌gv3101，得到重组农杆菌，命名为gv3101/pcambia2300。三、转gmscs06基因拟南芥的获得1、采用拟南芥花序浸花转化法(clough，s.j.，andbent，a.f..floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.(1998)16，735-743.)，将步骤二中1制备的gv3101/pcambia2300-gmscs06转至野生型拟南芥中，获得t1代转gmscs06基因拟南芥的种子。2、将t1代转gmscs06基因拟南芥的种子种植于含50mg/l卡那霉素的ms培养基上，22℃培养7-10d，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为t1代转gmscs06基因阳性苗。t1代转gmscs06基因阳性植株收到的种子即为t2代转gmscs06基因拟南芥的种子。3、将步骤2筛选出的不同株系的t2代转gmscs06基因拟南芥的种子播种于含50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为gmscs06基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性植株收到的种子即为t3代转gmscs06基因拟南芥的种子。4、将步骤3筛选出的t3代转gmscs06基因拟南芥的种子再次播种于含50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为t3代纯合转gmscs06基因拟南芥株系。将筛选到的16个t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株系依次命名为l1-l16。四、转空载体拟南芥的获得按照上述步骤三的方法，将gv3101/pcambia2300-gmscs06替换为gv3101/pcambia2300，其它步骤均相同，得到t3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。五、表达量分析及过表达株系的筛选待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、l1至l16的种子。(1)取5粒待测拟南芥种子，播种于ms培养基上，光暗交替培养8d，得到待测拟南芥幼苗。(2)完成步骤(1)后，提取各待测拟南芥幼苗的总rna，用逆转录酶反转得到cdna，对cdna中gmscs06基因的表达量进行实时定量分析，鉴定gmscs06基因的引物为5’-cctccactgttcttaaact-3’和5’-gaaccatccacaatctct-3’。结果表明，gmscs06基因为拟南芥外源基因，在野生型拟南芥和转空载体拟南芥中几乎没有表达，但gmscs06基因在16个t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株系中都有不同程度的表达。因此，16个t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株系均为t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株系。选取三个t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株系(即l5、l16和l17)进行后续试验。六、抗逆性鉴定待测拟南芥种子为野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、l5的种子、l16的种子或l17的种子。1、抗盐性鉴定实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：取30粒待测拟南芥种子，消毒后播种于ms培养基上，先4℃放置3d，再光暗交替培养7d，移栽至盛有营养土的盆中，光暗交替培养4周；然后开始通过施加含300mmnacl的1/2霍格兰营养液进行高盐胁迫(每隔2天施加一次；每次将含300mmnacl的1/2霍格兰营养液置于种植有拟南芥的盆外部，待盆中的营养土饱和吸收后，弃去盆外部的剩余溶液)，高盐胁迫10d，得到高盐胁迫的待测拟南芥植株。观察高盐胁迫的待测拟南芥植株的生长状态，测量高盐胁迫的待测拟南芥植株的株高和生物量，并统计存活率。存活率＝存活的拟南芥幼苗数/30×100％。部分实验结果见图1(wt为野生型拟南芥)。结果表明，高盐胁迫下，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的叶片、花序和茎大部分变白，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥株系(l5、l16或l17)的叶片、花序和茎多数呈绿色(症状较轻)；与野生型拟南芥的存活率(存活率为12.4％)相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的存活率显著提高(存活率为58.0％-87.7％)，而转空载体拟南芥的存活率无显著差异；与野生型拟南芥的株高相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株高显著增加，而转空载体拟南芥的株高无显著差异；与野生型拟南芥的生物量相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的生物量显著增加，而转空载体拟南芥的生物量无显著差异。2、抗旱性鉴定实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：取30粒待测拟南芥种子，消毒后播种于ms培养基上，先4℃放置3d，再光暗交替培养7d，移栽至剩有营养土的盆中，光暗交替培养4周；然后开始通过停止浇水进行干旱胁迫，干旱胁迫14d；然后正常浇水，复水处理3d，得到干旱胁迫的待测拟南芥植株。观察干旱胁迫的待测拟南芥植株的生长状态，测量干旱胁迫的待测拟南芥植株的株高和生物量，并统计存活率。存活率＝存活的拟南芥幼苗数/30×100％。部分实验结果见图2(wt为野生型拟南芥)。结果表明，干旱胁迫下，野生型拟南芥和转空载体拟南芥的叶片萎蔫、花序下垂、生长基本停止，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥株系(l5、l16或l17)仅有少数叶片萎蔫、花序生长正常、植株仍显绿色；与野生型拟南芥的存活率(存活率为4.9％)相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的存活率显著提高(存活率为58.0％-85.2％))，而转空载体拟南芥的存活率无显著差异；与野生型拟南芥的株高相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的株高显著增加，而转空载体拟南芥的株高无显著差异；与野生型拟南芥的生物量相比，t3代纯合转gmscs06基因拟南芥的生物量显著增加，而转空载体拟南芥的生物量无显著差异。上述结果表明，过表达gmscs06基因能显著提高转基因拟南芥植株的抗盐性和抗旱性。<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>蛋白质gmscs06在调控植物抗逆性中的应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1511<212>dna<213>大豆glycinemax(l.)merr.<400>1gtttgaggagccacttgtggggttcacagttcacactatcgctgactgatacaataataa60tgaccttcctcctttccttcctccactgttcttaaactcgttaataaaccaaacacaggc120aaaagactggtattactgtgttagtgttaccttaccactcaggcaaaataatggggagta180agaaaaaaaatggtggaaagggagagattgtggatggttccaagattatggagttagttg240gaaacgagaaagttttcagcaactttgtggaccataagtttgatgaattggataaagaca300gagatgggaaactctccatgaaggagcttgaacctgctgttgctgacattggtgctggtc360ttggtttgcctgctcaaggcactagtcctgattcagatcacatttattttgaggtcttga420atgagttcacccatggcaagcaagaaaaagtgagcaagactgagtttaaagaggttctct480cagacattctgttgggcatggctgctggactaaagcgagaccctattgttatactccgca540tggatggggaagatctccttgagtttgttaatggtccaagttatgaagcagaaatggcat600ccattttctctcagattgagtcccctagtggatcctttcgtgaacatgtaattgaagctt660ttgggagactcactgttgatcaaggaattcctccaacatcagattcttgggttttcaaca720acattgtggatccagcactatctcaaggtggccctgctttggacaagcctgcttctcaag780agacatttttggaagaatttaagaaagtcgcattgagcgtggttgattttcttaaagaga840aacctgtcattgttgcccacagtgaaaacacatttgatggacgcggtgtcaagagacttt900tatccaacaagtttgaattagacaggacgttgaacttagctttagagaatctgccaaaag960atcgcaatggaaaaatatcaaaggactatctgcgggtggcactagatctggtgtctccat1020ctgctggtttacctccagttggtgcaattgaagagattgataaggtcattgttgaagcct1080ttaagatggtgaatgcagaggacaccaagacagttaaagaagacgaatttaagaaaattt1140taactgaaatactgggtagtatcatgttgcagttagaaggcaatcccatatctgtttctt1200caaattcagttgtgcatgagcctttaggctcatcttctacactcttgcagccatcttcta1260gtgaaacagcataactgtctcaagtttgtgacggatcaaaaaccaagtacaataagaatt1320tttattcatggaaattgttacggaaatagtttgtctttaaagaattcactttgtatgatg1380tggattatttatgaatctgaaaattatagaatgccatggaaagaaaaaaaaattgttaat1440tatcccttgccgggcttgtttatcacctcagttgtaatttagatagatgtgctgtaggca1500gttggtggcaa1511<210>2<211>367<212>prt<213>大豆glycinemax(l.)merr.<400>2metglyserlyslyslysasnglyglylysglygluilevalaspgly151015serlysilemetgluleuvalglyasnglulysvalpheserasnphe202530valasphislyspheaspgluleuasplysaspargaspglylysleu354045sermetlysgluleugluproalavalalaaspileglyalaglyleu505560glyleuproalaglnglythrserproaspserasphisiletyrphe65707580gluvalleuasngluphethrhisglylysglnglulysvalserlys859095thrgluphelysgluvalleuseraspileleuleuglymetalaala100105110glyleulysargaspproilevalileleuargmetaspglygluasp115120125leuleugluphevalasnglyprosertyrglualaglumetalaser130135140ilepheserglnilegluserproserglyserphearggluhisval145150155160ileglualapheglyargleuthrvalaspglnglyileproprothr165170175seraspsertrpvalpheasnasnilevalaspproalaleusergln180185190glyglyproalaleuasplysproalaserglngluthrpheleuglu195200205gluphelyslysvalalaleuservalvalasppheleulysglulys210215220provalilevalalahissergluasnthrpheaspglyargglyval225230235240lysargleuleuserasnlysphegluleuaspargthrleuasnleu245250255alaleugluasnleuprolysaspargasnglylysileserlysasp260265270tyrleuargvalalaleuaspleuvalserproseralaglyleupro275280285provalglyalaileglugluileasplysvalilevalglualaphe290295300lysmetvalasnalagluaspthrlysthrvallysgluaspgluphe305310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