低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用的制作方法

本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体涉及一个可以提高低温抗性的PpFAD3-2基因。

背景技术：

低温贮藏是有效延长采后果实贮藏期的生产措施。然而对于桃等冷敏性的果实，较长时间的低温会造成生理代谢失调，导致冷害症状，从而丧失品质和商品性。为了减轻或者延缓桃果实采后低温贮藏导致的冷害，先后研发了基于温度、气体、化学处理等多种采后保鲜措施。通过基因工程手段增加低温抗性已经在拟南芥、水稻、番茄、杨树和柑橘等多种植物中实施，挖掘和鉴别桃果实低温应答基因开始展示出巨大的应用潜力。

通常认为，较高的不饱和脂肪酸含量能有效降低生物膜的相变温度，维持膜的流动性，以适应低温环境，由此延缓或减轻果实冷害并维持良好品质。拟南芥等模式植物研究表明，FAD是脂肪酸去饱和酶，参与不饱和脂肪酸合成，在应答低温过程中具有重要作用。FAD包含多个基因家族成员，不同成员可能具有不同的功能。有关桃果实采后低温诱导表达的FAD基因有待进一步鉴别，相关的基因功能也有待阐明。桃基因组测序的完成，转录组测序技术普及以及基因功能验证技术的进步，使得鉴别低温诱导FAD并开展功能应用成为可能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一个低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2，所述PpFAD3-2基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。

该基因特征功能如下：

基因表达特征：低温诱导PpFAD3-2表达。桃果实置于采后0℃低温贮藏，PpFAD3-2表达水平持续增加，从低温转至常温20℃货架则显著抑制基因表达。

本发明的另一个目的是提供所述低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2在基因工程中的应用。

所述应用是利用基因工程技术将PpFAD3-2_SK重组载体转化普通烟草，采用SEQ:NO.6和SEQ:NO.7列构建转基因载体，过量表达PpFAD3-2显著提高烟草植株在低温下的存活率，显著提高不饱和脂肪酸亚麻酸18:3含量。

所述应用是利用引物对SEQ:NO.4和SEQ:NO.5构建重组蛋白，在酿酒酵母中异源表达催化亚麻酸合成。

本发明提供一个来源于桃的PpFAD3-2基因，在酵母中进行的体外功能验证表明，PpFAD3-2可以催化不饱和脂肪酸亚麻酸(18:3)合成。桃果实采后低温贮藏诱导了PpFAD3-2表达，转至常温货架则显著降低该基因表达。在烟草中过量表达PpFAD3-2显著增加了不饱和脂肪酸亚麻酸含量，提高了在低温条件下的存活率，具有重要的应用价值。体外构建的PpFAD3-2重组蛋白在酿酒酵母中进行异源表达可催化亚麻酸生物合成，具有营养保健的应用潜力。

附图说明

图1：桃果实采后低温处理诱导PpFAD3-2表达。

图2：过量表达PpFAD3-2的显著增加烟草植株低温条件下的存活率。

图3：过量表达PpFAD3-2显著增加转基因烟草的亚麻酸含量。

图4：酿酒酵母异源表达PpFAD3-2编码蛋白催化亚麻酸合成。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：PpFAD3-2基因的克隆

(一)实验方法

以拟南芥中AtFAD3为参考序列，应用blastp算法查找桃基因组数据库的同源序列，选取匹配度最高的序列，设计引物对SEQ:NO.2和SEQ:NO.3，以桃cDNA为模板，进行PCR扩增及测序分析，获得PpFAD3-2序列SEQ:NO.1。PCR反应体系为50μl，成分分别为：0.5μl Taq酶(Roche)，5μl缓冲液(10×)，4μl dNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，Invitrogen)各2μl，4μl cDNA，32.5μl H2O。RT-qPCR反应程序为95℃反应5min；95℃反应30s，58℃反应30s，72℃延伸2min，37个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

(二)实验结果

经测序验证，获得与桃果实基因组数据库相匹配的PpFAD3-2序列SEQ:NO.1。

实施例2：温度处理对桃果实PpFAD3-2基因表达的影响

(一)实验方法

1.桃果实材料

商业成熟的桃果实，选择大小均匀，成熟度一致，无明显病虫害或机械损伤的果实作为材料。初始点取样后，将果实随机分为3组进行贮藏：第一组果实一直置于0℃，第二组果实置于20℃，第三组果实是0℃贮藏72h后转移至20℃货架72h。每个取样点设置3个生物学重复，每个重复3个果实，共计9个果实。

2.基因表达分析

利用CTAB法提取桃果实总RNA，最后用去RNase的DEPC水溶解。总RNA纯度根据NanoPhotometer^TM Pearl User Manual测定，干冰运输至生物公司进行转录组测序，基因表达水平用RPKM值表示。

(二)实验结果

桃果实PpFAD3-2表达被低温诱导，从低温转至常温20℃货架显著抑制基因表达(图1)。

实施例3：转基因烟草过量表达PpFAD3-2提高低温下植株的存活率

(一)实验方法

1.载体构建

结合引物对SEQ:NO.6和SEQ:NO.7，利用PCR技术扩增获得PpFAD3-2。PCR产物和目标载体(pGreen 0029 62-SK)用限制性内切酶BglⅡ和Eco RI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证，将序列确认正确的质粒利用电击法转化农杆菌株系GV3101::pSoup。

2.转基因植株鉴定

经基因工程技术转化普通烟草获得转化植株后，需要进一步通过PCR和qPCR手段进行验证。利用CTAB法提取烟草叶片DNA，利用所得的DNA做模板，结合引物对SEQ:NO.10和SEQ:NO.11，用PCR进行转基因植株鉴定。

取经过PCR鉴定的植株叶片，利用TRIzol(Invitrogen)提取烟草总RNA，用TURBO DNase Kit(Ambion)试剂盒去除基因组DNA污染后，取1.0μg RNA按iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)试剂说明书操作合成cDNA。RT-qPCR检测中，PpFAD3-2引物对为SEQ:NO8和SEQ NO.9，以普通烟草EF1-α基因(SEQ:NO.12)作为内参基因，引物为SEQ:NO.13和SEQ:NO.14。qPCR反应体系包括10μl Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μl，2μl cDNA，6μl H2O。反应程序为95℃反应3min；95℃反应10s，60℃反应30s，45个循环。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，每次检测都包括以H2O作反应模板的阴性对照。

3.植株的低温处理和存活率统计

转基因和非转基因的烟草植株在-2℃低温处理10d，然后转移到20℃恢复10d，统计植株的存活率并拍照记录。

(二)实验结果

过量表达PpFAD3-2的转基因烟草植株，低温处理后的存活率约72％，显著高于非转基因对照植株的17.2％(图2)，表明在过量表达桃果实PpFAD3-2显著增强了植株的低温抗性。

实施例4：转基因烟草过量表达PpFAD3-2增加亚麻酸含量

(一)实验方法

1.载体构建和转基因植株鉴定

实验方法见实施例2。

2.脂肪酸检测

取0.2g充分研磨的烟草叶片转移至50ml离心管中，加入15ml正己烷：异丙醇(V:V＝3:2)溶液和7.5ml的0.67％Na2SO4(m:v＝0.67％)溶液，涡旋2min混匀后，在10000g，4℃条件下离心10min。转移上清至新的50ml离心管中，于原离心管中加入15ml正己烷：异丙醇溶液，涡旋2min后离心，条件同前，合并两次上清，加入100μl浓度为8mg/ml的内标十七烷酸(17:0)。45℃旋转蒸干溶液，然后加入3ml甲酯化溶液(甲醇：甲苯：浓H2SO4＝88:10:2，体积比)，涡旋混匀后将其加入4ml带盖玻璃小瓶中，80℃水浴1h，进行甲酯化反应。完成后，加入1ml正庚烷，颠倒混匀，充分静置后，吸取上层300μl上层溶液，加入约0.5g无水硫酸钠，除去多余水分，再用0.22μm有机滤膜除去杂质后，样品即可进行GC检测。检测所用色谱柱为DB-Wax(30m×0.25mm ID，0.25μm，Agilent，美国)，升温程序为50℃，1min，然后以25℃/min的速率升至200℃，以3℃/min的速度升至230℃，保持3min。

(二)实验结果

与非转基因的野生型对照植株相比，过量表达PpFAD3-2的转基因烟草亚麻酸含量(18:3)显著增加(图3)，表明该基因参与了植物体内的亚麻酸合成。

实施例5：酿酒酵母异源表达PpFAD3-2催化亚麻酸合成

(一)实验方法

1.重组载体构建和酵母转化

结合引物对SEQ:NO.4和SEQ:NO.5，利用PCR技术扩增获得PpFAD3-2。PCR产物和目标载体(pYES2NT/C，Invitrogen)用限制性内切酶BglⅡ和Eco RI酶切后，分别连接，转化大肠杆菌，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的质粒利用LiAC法(Clontech)转化至酿酒酵母株系INVSc1。

2.诱导表达

挑取3个单菌落于15ml SD–Ura+glucose培养液，在30℃，250rpm摇床上培养至OD600为0.4～0.5。将菌液转移至离心管中，离心5min后弃上清，然后加入50ml SD–Ura+galactose悬浮菌体。加入10μl亚油酸标准品(Sigma)，NP-40(鼎国)500μl，培养24h。离心收集菌体后，加入1ml无菌水，12000rpm离心30s，弃上清，然后将收集的菌体于-80℃保存。

3.脂肪酸检测

将收集的菌体用液氮研磨，转移至10ml离心管中，加入5ml正己烷：异丙醇(v:v＝3:2)溶液和2.5ml Na2SO4溶液(m:v＝0.67％)，经过10000g和4℃条件下离心10min后，加入内标十七烷酸(17:0)。45℃旋转蒸干溶液，然后加入3ml甲酯化溶液(甲醇：甲苯：浓H2SO4＝88:10:2)，涡旋混匀后将其加入4ml带盖玻璃小瓶中，80℃水浴1h，进行甲酯化反应。完成后，加入1ml正庚烷，颠倒混匀，充分静置后，吸取上层300μl上层溶液，加入约0.5g无水硫酸钠，除去多余水分，再用0.22μm有机滤膜除去杂质后进行GC检测。检测所用色谱柱为DB-Wax(30m×0.25mm ID，0.25μm)，升温程序为50℃，1min，然后以25℃/min的速率升至200℃，以3℃/min的速度升至230℃，保持3min。所添加的内标十七烷酸(17:0)浓度为4mg·ml^-1，添加50μl。

(二)实验结果

在酿酒酵母中诱导PpFAD3-2_pYES重组载体表达，催化产生了野生型对照酿酒酵母中不存在的亚麻酸(18:3)(图4)，证明PpFAD3-2编码的去饱和酶具有ω-3去饱和功能，参与了亚麻酸的生物合成。

对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 低温诱导表达的桃基因PpFAD3-2及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 碧桃(Prunus persica)

<400> 1

atggtggagg ctcagagcaa acccatgaat ggggttaatg ggatccataa ccacaacaaa 60

caagatgaag ctgattttga cccaagtgcc cctcctccct ttaagatagc tgagatccgt 120

gctgccattc ccaaacactg ttgggtcaag aatccatgga ggtctatgag ttatgtcttc 180

agggatttgt ttgtgatatt tgcaatggca tctgctgcca tttacttgga aagttggtat 240

ctttggccag tttactgggc tgctcaagga accatgttct gggctctgtt tgttcttgga 300

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tattcaagtt tgcatgaaag tacaagaaaa ttcagattca gagtgccata ccccatcttt 540

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tacagtgact tgtttgcccc aaatgaaagg aaagatgtga taacttcaac tgtttgctgg 660

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catcaccatg gttacgatca aaaacttccc tggtaccgtg gcaaggaatg gagttatcta 840

cggggaggcc tcacaaccgt tgatcgtgat tatggaatgt tcaataacat ccaccatgac 900

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gctaccaagg cagccaagcc agttctggga aagtactatc gggagccaaa gaaatctgga 1020

ccatttccgg ttcacttgat cgataatcta atgacaagca tgagcaatga tcactatgtt 1080

agtgacactg gagacgttgt atactatcag actgacccca agcttttcaa aagtcttaag 1140

agcaagtcta gttga 1155

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

atggtggagg ctcagagcaa 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

tcaactagac ttgctcttaa gacttttg 28

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

tatgaattcg ccaccatggt ggaggctcag agca 34

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gcctctagat caactagact tgctcttaag act 33

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

atatctagaa tggtggaggc tcagagca 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

ggcgaattct caactagact tgctcttaag 30

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

attgagatgg cagggatgaa 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

ccttctcaag gtttttcagc a 21

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

aatcccacta tccttcgcaa gacccttc 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

agagactggt gatttcagcg aattggtac 29

<210> 12

<211> 1344

<212> DNA

<213> 烟草(Nicotiana tabacum)

<400> 12

atgggtaaag agaaggttca catcaacatt gtggtcattg gccacgtcga ctctggtaag 60

tcgactacca ctggtcactt gatctacctt ggtggtattg acaagcgtgt cattgagagg 120

tttgagaaag aagctgctga gatgcacaag cggtcattca agtatgcctg ggtgcttgac 180

aaactaaagg ctgagcgtga ccggggtatc actattgata tcgccttgtg gaagtttgag 240

accaccaagt actactgcac tgtgattgat cgtcctggac acagggattt catcaagaat 300

atgattactg gtacctcccg tgcctgtcgt gtcctgattg ttgcctccac cactggcttt 360

gcacaagctg gtaatctcaa ggatggacag acccgtgaaa gactgcttat tgactccacc 420

actggtaaca cccttggtgt cacccaaatg atttgctgct gcaacaagat ggatgctacc 480

acccccaagt attccaaggc taggtacgat gaaatcgtga aggaggtttc ttcctacctc 540

aagaaggtag gatacaaccc tgacaagatc ccctttgtcc ccatctctgg tttggaaggt 600

gacaacatgc tcgaaagatc aacaaacctt gactggtaca agggcccaac acttcttgat 660

gctcttgacc agattaatga gcccaagagg cccacagaca agcctctcag gctcccactt 720

caggatgttt acaagattgg tggaattggt actgtccctg ttggtcgtgt ggaaactggt 780

gtcctcaagc ctggtatggt tgttactttt ggtcccactg gtctgaccac tgaagttgga 840

tctgttgaga tgcaccacga agctcttcag gaggcacttc ctggtgacaa tgttggattt 900

aatgtcaaga atgttgcggt taaggatctc aagcgtgggt ttgttgcttc caactccgga 960

tgtcccagca atgggtgctt cagctttacc tcccaagcta tcatcatgaa ccattcagga 1020

cagattggca atggatatgc tccagttctg gactgccaca cctcccatgc tgtcagtgca 1080

gaaattttga ccaatattgc caggcgttct ggtcaggaga ttgcgaaaga gcccaggttc 1140

cttttgaatg gttgtgctgg ttttgttatg atgattccca ccctacccat ggttgttgca 1200

aggatcctct ctgcgtaccc accattggag cgttttgcgt tcaggagcat gcgtcaaact 1260

gttgctgttg gtgttatcaa gaacgttgtc aagaaggacc caactggtgc tatggtcacc 1320

aaggctgctc agaagaagaa atga 1344

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

gcccaacact tcttgatgct c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

gacaccagtt tccacacgac 20