本发明属于基因治疗领域，更具体地，涉及一种靶向基因UBE2J2的修饰siRNA及其应用。
背景技术：
：：肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌大国，我国的肝癌患者占了全世界一半以上。肝癌也是致死率最高的癌症之一，平均五年生存率只有5％。目前手术治疗与肝脏移植仍然是肝癌治疗的首选方案。但很多患者往往确诊的时候已经处于晚期，无法采用手术治疗。肿瘤转移是造成大于90％癌症患者死亡的主要原因。由于肝癌细胞恶性度高，癌组织生长迅速，加上肝脏的双血管供应特点，肝脏内血液丰富，所以肝癌细胞很容易通过血流转移到肝内其他部位而发生肝癌转移。基因靶向治疗是目前癌症治疗的前沿技术。通过对与肝癌相关基因表达的干扰，从而抑制肝癌发生与肝癌转移，对提高我国肝癌精准治疗水平，具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种靶向基因UBE2J2(SEQIDNO：5所示)的修饰siRNA及其应用。本发明通过设计合成UBE2J2的siRNA并加以化学修饰(命名为UBE2J2StableTMsiRNA)，用肝癌荷瘤小鼠与肝癌转移小鼠动物模型进行验证，确定UBE2J2StableTMsiRNA具有抑制肝癌生长、抑制肝癌转移的作用，为肝癌治疗提供新的靶标和新的思路。本发明的第一方面提供一种靶向基因UBE2J2的修饰siRNA，该修饰siRNA由正义链和反义链组成；所述正义链的序列如SEQIDNO：1所示，所述反义链的序列如SEQIDNO：2所示，5’-CCAGAGAAUUUCCUUUCAATT-3’(SEQIDNO：1)5’-UUGAAAGGAAAUUCUCUGGTT-3’(SEQIDNO：2)其中，序列中U均为2’-Fluoro-dU修饰。Fluoro-dU修饰进一步提高了siRNA的稳定性。本发明的第二方面提供所述的靶向基因UBE2J2的修饰siRNA在制备治疗肝癌的药物中的应用。其中，所述治疗肝癌包括抑制肝癌细胞增殖和/或抑制肝癌细胞转移。所述肝癌细胞包括但不限于HCCLM3肝癌细胞。经过构建的两个动物模型测试证明，本发明的UBE2J2siRNA能显著抑制肝癌生长与肝癌转移，可作为肝癌靶向治疗的新靶标，具有潜在的临床应用前景。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。图1-2示出了westernblot分析UBE2J2StableTMsiRNA对UBE2J2的长效抑制作用。图3-6示出了荷瘤实验验证UBE2J2StableTMsiRNA具有抑制肝癌生长、抑制CD34与AFP表达的活性。图7-8示出了细胞克隆形成实验验证UBE2J2StableTMsiRNA具有抑制肝癌细胞侵袭扩散的活性。图9-10示出了小鼠肝癌转移实验验证UBE2J2StableTMsiRNA具有体内抑制肝癌转移的活性。具体实施方式下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中采用ShcrambleStableTMsiRNA作为对照组，其序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQIDNO：3)5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQIDNO：4)。实施例1体外验证UBE2J2StableTMsiRNA能长效干扰UBE2J2蛋白表达。10μgUBE2J2StableTMsiRNA或ShcrambleStableTMsiRNA加上2μllipid2000溶于50ulPBS，转染到HCCLM3肝癌细胞。当天、第3天、第6天、第9天和第12天分别用RIPA裂解细胞，提取蛋白。通过westernblot分析UBE2J2蛋白表达情况。如图1-2所示，westernblot分析结果显示，ShcrambleStableTMsiRNA对UBE2J2蛋白表达基本无影响，UBE2J2StableTMsiRNA在当天、第3天、第6天、第9天和第12天对UBE2J2的抑制率分别为75％、78％、72％、65％和54％，体外抑制效果显著。实施例2体内验证UBE2J2StableTMsiRNA具有抑制肝癌生长的活性。16只5周龄Balb/c无胸腺免疫小鼠分成两组，SPF级饲料无菌室喂养。10μgUBE2J2StableTMsiRNA或ShcrambleStableTMsiRNA加上2μllipid2000溶于50ulPBS，转染到HCCLM3肝癌细胞(1×106)，打入小鼠右前肢腋下。一周后成瘤，每周于肿瘤附近注射相同剂量的UBE2J2StableTMsiRNA与lipid2000混合液或ShcrambleStableTMsiRNA与lipid2000混合液，连续5周。每周称重，并量取肿瘤大小。肿瘤大小计算按照以下公式：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。第六周解剖小鼠，称取肿瘤重量。肿瘤用福尔马林固定后做石蜡切片，并用CD34抗体与AFP抗体做免疫组化染色。如图3-6所示，小鼠荷瘤实验结果显示，UBE2J2StableTMsiRNA对肝癌细胞荷瘤生长的抑制作用显著，对CD34，AFP等肝癌标志物表达水平有明显抑制作用，提示UBE2J2StableTMsiRNA具有良好的抗肝癌疗效。实施例3体外验证UBE2J2siRNA具有抗肿瘤细胞侵袭扩散的作用。高转移肝癌HCCLM3细胞转染UBE2J2StableTMsiRNA或ShcrambleStableTMsiRNA(10μgsiRNA+2ullipid2000)，低密度(1000/皿)在6cm培养皿连续培养两周，每四天换一次培养基，第二次换培养基时重复一次转染。第二周结束统计细胞克隆数量，观察克隆形态差异变化。如图7-8所示，细胞克隆形成实验结果表明，UBE2J2StableTMsiRNA明显抑制HCCLM3肝癌细胞克隆的形成。与对照组分散的细胞克隆形态相比，UBE2J2StableTMsiRNA处理的细胞克隆，细胞间隙小，呈聚拢状，表明UBE2J2StableTMsiRNA具有抑制肝癌细胞侵袭扩散的作用。实施例4体内验证UBE2J2siRNA具有抗肝癌转移的作用。10μgUBE2J2StableTMsiRNA或ShcrambleStableTMsiRNA加上2μllipid2000溶于50ulPBS，转染到HCCLM3肝癌细胞(1×106)，转染的细胞通过尾部进行静脉注射到5周龄的balb/c裸鼠。每隔一周尾部注射相同剂量的siRNA/lipid2000混合液，连续5周。第六周解剖小鼠，统计肝脏肿瘤转移灶数量。如图9-10所示，小鼠肝癌转移动物模型结果显示，UBE2J2StableTMsiRNA明显地抑制肝癌细胞在小鼠肝脏形成新的转移灶，表明其良好的抑制肝癌转移疗效。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。序列表<110>清华大学深圳研究生院<120>一种靶向基因UBE2J2的修饰siRNA及其应用<130>1700557<160>5<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>21<212>DNA/RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1ccagagaauuuccuuucaatt21<210>2<211>21<212>DNA/RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2uugaaaggaaauucucuggtt21<210>3<211>20<212>DNA/RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>3ucuccgaacgugucacgutt20<210>4<211>21<212>DNA/RNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>4acgugacacguucggagaatt21<210>5<211>624<212>DNA/RNA<213>Homosapiens<400>5atgaccccttatgaaggtggctattatcatggaaaactaatttttcccagagaatttcct60ttcaaacctcccagtatctatatgatcactcccaacgggaggtttaagtgcaacaccagg120ctgtgtctttctatcacggatttccacccggacacgtggaacccggcctggtctgtctcc180accatcctgactgggctcctgagcttcatggtggagaagggccccaccctgggcagtata240gagacgtcggacttcacgaaaagacaactggcagtgcagagtttagcatttaatttgaaa300gataaagtcttttgtgaattatttcctgaagtcgtggaggagattaaacaaaaacagaaa360gcacaagacgaactcagtagcagaccccagactctccccttgccagacgtggttccagac420ggggagacgcacctcgtccagaacgggattcagctgctcaacgggcatgcgccgggggcc480gtcccaaacctcgcagggctccagcaggccaaccggcaccacggactcctgggtggcgcc540ctggcgaacttgtttgtgatagttgggtttgcagcctttgcttacacggtcaagtacgtg600ctgaggagcatcgcgcaggagtga624当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3