一种羔羊粪菌液的制备方法与流程

背景技术：

羔羊腹泻是一种常见的消化道疾病，也是引起羔羊死亡的重要原因之一。该病是由多种原因引起的，根据致病因素可分为病毒性腹泻、细菌性腹泻、寄生虫性腹泻以及因饲养管理不当、母羊及羔羊自身免疫力低下引起的非传染性腹泻等。该病会造成较大的经济损失，因此做好羔羊腹泻的防治工作对提高羊场经济效益具有重要意义。

目前羔羊发生腹泻时，大多采用抗生素进行治疗。虽然抗生素治疗腹泻有一定的效果，但滥用抗生素会导致细菌耐药性增加、引起畜禽内源性感染和二重感染以及在畜产品和环境中造成残留等问题，这极大威胁着人类的身体健康。2016年欧盟国家颁布兽药法律禁止对动物进行合并性或预防性抗生素治疗，我国农业部也相继出台法规，限制畜禽水产品中违规使用抗生素。

粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是将健康供体粪便中的菌群，通过特殊方式植入患者的肠道内，从而调节患者的肠道菌群，使患者恢复正常的肠道微生态系统，为治疗因肠道菌群失调导致的各种肠道内外疾病提供一种新的治疗手段。近年来，随着肠道微生态失调性疾病的高发及现有治疗措施的缺陷，FMT逐渐被重视起来应用于各项临床研究及治疗。大量研究表明FMT对艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection CDI)的治疗成功率可达90％。目前粪菌移植在兽医临床案例中应用较少，尚未有采用FMT技术治疗羔羊腹泻研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于：采用FMT技术的理念，制备用于治疗羔羊腹泻疾病的粪菌液，并通过实践中建立并优化移植途径与治疗程序，同时与抗生素治疗效果进行对比，分析病畜胃肠菌群的改善状况，从而证明本发明的显著效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种羔羊粪菌液的制备方法，该制备方法包括下述步骤：

(1)严格挑选粪菌液的供体为4～6月龄雌雄对半的健康供体羊，其生理生化指标均正常，未注射过抗生素类药物，且粪便呈直径0.8-1cm均匀的颗粒状；

(2)针对步骤(1)中的供体羊，操作时手戴无菌医用手套刺激其肛门待其有排便反应，直肠扣取不接触地面的新鲜粪便；

(3)将上述取得的新鲜粪便50～60g于500ml灭菌容器中，捣碎后加生理盐水稀释，按照1︰10体积比混匀成匀浆状，备用；

(4)将步骤(3)中制备的新鲜粪便液用双层无菌纱布覆盖反复3～4次过滤，最后倒入无菌离心管中，得到棕黄色混浊液体，备用；

(5)将步骤(4)中制备好的棕黄色混浊液体在粗滤的基础上进行离心，去除上清液，加生理盐水重悬沉淀，即制备成145～155ml、浓度为33％～40％的粪菌液。

进一步优化，上述步骤(3)～步骤(5)制备过程在超净工作台中进行，避免环境杂菌污染。

进一步优化，步骤(5)中将粗滤后的粪液以6000/min的速度离心15min效果最佳，可得上方棕黄色透明液体，下方微小颗粒沉淀。

本发明取得了如下有益效果：

(1)相比抗生素治疗，本羔羊粪菌液治愈速度缩短1～3天；与对照组相比，可提高羔羊日增重，且与抗生素治疗比较无显著差异(P>0.05)；促进了羔羊生长，有效治疗羔羊腹泻。(2)经粪菌液移植治疗后的羔羊的白细胞数目和淋巴细胞低于对照组，接近正常水平。说明FMT技术可缓解腹泻羔羊引起的炎症，提高了机体免疫力。(3)本发明中粪菌液移植与抗生素治疗作对比，粪菌液移植取得了具有良好的治疗效果。这说明本发明制备的粪菌液移植能够替代抗生素使用，减少了使用抗生素带来的动物耐药性隐患。(4)羔羊发生腹泻时会伴随炎症反应，与对照组相比，本发明制备的粪菌液移植治疗能够显著降低促炎因子水平，使之接近正常水平，说明粪菌液移植能够减轻腹泻带来的炎症反应。

附图说明

图1是粪菌移植与抗生素治疗羔羊腹泻用时对比；其中：FMT，粪菌移植组；NF，恩诺沙星治疗组；NF+FMT，恩诺沙星处理后粪菌移植组；Gentamycin，庆大霉素组处理组；GM+FMT，庆大霉素处理后粪菌移植组；SC，生理盐水对照组；图2是粪菌移植与抗生素治疗羔羊腹泻时日增重对比；图3是不同治疗方式对炎性因子的影响。

具体实施方式

实施例1本发明提供了一种羔羊粪菌液的制备方法，包含以下步骤：

步骤(1)粪菌液的供体为4～6月龄左右公母对半的健康青年羊，其生理生化指标均正常，未注射过抗生素类药物，且粪便呈直径1cm左右均匀的颗粒状；

步骤(2)所述的新鲜粪便为手戴无菌PE手套刺激青年羊肛门待其有排便反应，直肠扣取不接触地面的新鲜粪便；

(3)取新鲜粪便50～60g于500ml灭菌容器中，捣碎后加生理盐水稀释，涡旋混匀成匀浆状；1:10体积比混匀，此时制备粪菌液效果最好；

(4)用双层无菌纱布覆盖反复3-4次过滤最后倒入无菌离心管中，得到棕黄色混浊液体；

(5)在粗滤的基础上进行离心，去除上清液，加适当生理盐水重悬沉淀，制备成约150ml、浓度为33％～40％的粪菌液所述的将粗滤后的粪液以6000/min的速度离心15min效果最佳，可得上方棕黄色透明液体，下方微小颗粒沉淀。

上述步骤(3)-(5)在超净工作台中进行，避免环境杂菌污染。

优选的是，新鲜粪便在2h以内与生理盐水混匀，制备粪菌液，并于24h以内完成粪菌移植。当天采集、当天制备、当天移植，若有剩余可短暂储存于4度冰箱。

实践中，腹泻羔羊每天早晚两次接受口服上述方法制备的粪菌液液，根据腹泻羔羊体重，所用粪液剂量为3ml/Kg·次，粪菌液移植持续时间一般为3±1天。

实施例2、按照实施例1制备方法制备的粪菌液在生产实践中进行技术效果的验证

(一)试验动物及饲养条件

选取60只(24±2)日龄、平均体重为6.08±2.30kg的吮乳期公母对半的腹泻羔羊，所有羊都在封闭性羊舍中饲养，镂空式木质地板，自由饮水和采食。消毒、驱虫等免疫均由饲养管理人员进行，试验期1个月。

(二)试验处理

本试验随机分为6组，每组10只，公母各半。试验分组为：粪菌移植组(灌喂制备好的粪菌悬液-FMT组)；抗生素治疗Ⅰ组(按0.2ml/kg的剂量肌肉注射庆大霉素药液-GM组)；抗生素治疗Ⅱ组(按照0.05ml/kg肌注恩诺沙星药液-NF组)；庆大霉素+粪菌移植组(庆大霉素作为抗生素干预试剂，干预后灌喂粪菌悬液-GM+FMT组)；恩诺沙星+粪菌移植组(恩诺沙星作为抗生素干预试剂，干预后灌喂粪菌悬液-NF+FMT组)；对照组(采取口服灌注与粪液等量生理盐水)。对羔羊体重、治愈用时进行测定，静脉采血做生理生化指标检测、血清做细胞免疫因子检测，并观察治疗情况。

(三)测定指标与方法

治疗效果评价：腹泻羔羊粪便由最初的稀粪到正常的颗粒粪，体温正常，即为治愈。

血液生理生化指标测定：血液生理生化指标测定：采取腹泻第一天和治愈后第一天羔羊的血液，早上8点左右空腹在颈静脉采血两份各5ml于抗凝管和非抗凝管中，抗凝血用于血常规检测，检指标包括：红细胞计数、红细胞压积、血红蛋白浓度、白细胞计数、淋巴细胞计数、血小板计数等血常规指标。非抗凝管血液静置30min后以3 000r/min离心15min分离血清，检测生化指标包括：碱性磷酸酶、丙氨酸转移酶、血糖、磷、胆固醇、总蛋白、球蛋白等；细胞因子检测：采集腹泻和正常羔羊以及不同治疗后羔羊的非抗凝管血液，静置30min后以3 000r/min离心15min分离血清，用ELISA试剂盒检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素IL-2、IL-6、IL-8的吸光度值以反映各炎性细胞因子相对水平，具体操作按照试剂盒要求进行。

(四)试验结果与分析

试验结果由图1可知：与生理盐水对照组(SC组)相比，粪菌移植组(FMT组)显著缩短治愈用时(P<0.05)，与其他各组相比，FMT组的治愈时间最短，疗效最佳，治疗羔羊腹泻更有优势。

试验结果由图2可知：腹泻羔羊在接受FMT治疗后，平均日增重高于对照组，达到与抗生素一样的治疗效果，但未达到显著性差异(P>0.05)。这可能由于腹泻羔羊在移植菌群后，改善了肠道健康，促进机体对营养物质的消化吸收，从而提高了动物生长性能。

试验结果由图3可知：腹泻羔羊的肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ以及白细胞介素IL-2、IL-6、IL-8等炎症因子水平较正常羔羊均极显著升高(P<0.01)，这表明腹泻所致的炎症反应使得免疫细胞因子水平提高。与对照组相比，在接受粪菌移植后TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-8炎症因子显著下降，接近正常水平。这说明粪菌移植可能通过降低炎症因子的水平，有效参与机体免疫调节而改善免疫功能，使机体对病原体侵袭做出免疫应答，清除肠道黏膜的致病菌，有效改善的羔羊腹泻症状，达到治疗目的。

试验结果由表1(表1是不同治疗方式对腹泻羔羊血液生理指标的影响)可知：本试验发现羔羊发生腹泻时，其白细胞数和淋巴细胞数较正常组升高。经粪菌移植治疗后的羔羊的白细胞数目和淋巴细胞低于对照组，但未达到显著差异，最接近正常水平。这种结果可能是因为粪菌移植作为恢复肠道菌群平衡的方法，对致病菌有一定的拮抗作用，增强了机体免疫力；粪菌移植处理过程中，有益菌与引起腹泻的致病菌之间发生拮抗，有益菌生态占位，降低了有害菌的数量，增强了机体免疫功能，使得炎性细胞的数目得到有效控制。

试验结果由表2(表2是不同治疗方式对腹泻羔羊血液生化指标的影响)可知：本研究中生理盐水对照组的羔羊血液的碱性磷酸酶(ALKP)显著低于正常组(P<0.05)，经粪菌移植治疗后的羔羊的碱性磷酸酶含量显著高于对照组(P<0.05)，接近正常水平。这可能由于粪菌移植促进了肝脏和骨骼的发育，使得碱性磷酸酶含量增加，并提高了腹泻羔羊的日增重。

以上结果表明，粪菌移植治愈时间短，日增重与抗生素无差异(P>0.05)，通过降低炎症因子水平参与治疗腹泻过程中免疫应答反应。因此粪菌移植作为防治羔羊腹泻的一种无抗治疗手段，达到了与抗生素的一样的治疗效果。

由此可以证明：通过本方法制备的粪菌液在实践验证中起到非常显著的治疗和预防效果，完全可以替代抗生素在羔羊腹泻防治中的应用。

实施例3，按照本发明制备的粪菌液，移植治疗人临床疾病时所用粪便剂量50～60g/次，根据药物剂量换算关系，并结合前期预试验探究粪菌移植治疗羔羊腹泻的最佳剂量是采用正常羊粪便5～6g/次，制备菌液约15～18ml。

表1不同治疗方式对腹泻羔羊血液生理指标的影响

Table 1 Effects of different treatments on blood hematologic indexes of lamb diarrhea

注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。下表同。In the same row，values with different small letter superscripts mean significantly different(P＜0.05)，while values with different capital lettersuperscripts mean significantly different(P＜0.01).The same as below.

表2不同治疗方式对腹泻羔羊血液生化指标的影响

Table 2 Effects of different treatments on blood biochemical indexes of lamb diarrhea