一种人Y染色体微缺失检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于人核酸体外检测
技术领域：
，具体涉及人Y染色体微缺失多重PCR扩增系统和检测试剂盒。
背景技术：
：据世界卫生组织(WHO)统计，全球约有10-15％的夫妇患有不育症，而男性不育占一半。在男性不育中，半数以上属原因不明者，在这些病人中，约15％表现为无精子症、少精子症。除了输精管梗阻、内分泌异常、性功能障碍、先天性疾病、感染等病因外，相当一部分患者病因一直不明确。自1976年Tiepolo和Zuffardi发现无精子患者存在Yq11远端缺失以来，越来越多的报道支持Yq11远端存在精子发生调控基因，它们的缺失或突变可引起精子发生的异常。Y染色体上存在着精子发生调控基因即无精子症因子(AzoospermiaFactor，AZF)，其缺失引起的生精障碍是导致男性不育的重要原因，表现为原发性无精子症(Azoospermia)或少精症(Oligospermia)。现在研究表明，在精子发生障碍引起的男性不育患者中，继克氏综合症之后，Y染色体微缺失被认为是导致男性不育的第二遗传因素。Y染色体男性-特异区(MSY，male-specificregionoftheYchromosome)占整个Y染色体的95％，由拟常染色体区域构成其侧翼序列，基因微缺失的影响，MSY一般分为AZFa、AZFb、AZFc三个独立的亚区；有学者建议将AZFb与AZFc之间且最接近AZFc区列为AZFd区。在不育男性中，虽然由于病人选择标准的差异微缺失发生频率的变动范围较大。但相对来说，其发生频率在不育男性中较为常见，与寡精子症男性相比，无精子症男性拥有更高的微缺失发生率。不同实验室报告的缺失频率变动范围较大，从2％-10％(甚至更高)，这反映了缺失频率受研究人群组成差异的直接影响。AZF各亚区的缺失频率不同，基于Munster生殖医学研究所34个Y染色体微缺失病人的研究结果，AZFc亚区的缺失频率最高，占总缺失的79％；其次是AZFb，占9％；AZFbc占6％；AZFa的缺失频率最低，占3％，另外AZFabc(XX男性：占3％)。鉴于Y染色体微缺失在男性不育中的重要性以及不同的微缺失对男性不育后续治疗的重要指导价值，在2004年版欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控网(EMQN)关于Y染色体微缺失分子诊断最佳实践指南中，已将Y染色体微缺失检测推荐作为男性少精、无精症患者的常规检测项目以及辅助生殖前的必检项目。目前，对于Y染色体微缺失的检测手段或原理大部分参考2004年EAA/EMQN第一版标准指南。鉴于不同实验室的操作平台或条件各异，检测方法主要有三大类：PCR-凝胶电泳法，该法为传统分子检测手段，即通过终点PCR后进行琼脂糖凝胶电泳的目标条带的肉眼观察给予结果的判断，一般受PCR产物浓度、琼脂糖凝胶浓度等因素制约，且易受特异性电泳条带造成假阳性误判的影响，总体对整个PCR扩增条件及结果判断有较高要求，临床应用推广较难；PCR荧光探针法，该法以不同荧光标记的探针组合进行目标片段的快速扩增且实时定量，是目前快速分子诊断领域内常用的技术手段，通常会以多管反应进行目的片段扩增，收集扩增曲线的荧光信号后进行CT值分析，该法对PCR反应体系要求较高，且通常因为多管反应而造成通量相对较少，但不适合多位点检测的疾病快速筛查；MLPA法，该法原理是基于分子杂交并多重PCR联合毛细管电泳检测方，是目前较为肯定的一种分子快速诊断方法，但是由于试剂耗材昂贵、操作时间较长且对实验操作要求较高，在实际临床推广上相对困难。因此有必要建立一种较全面、高效能、快速、低成本的人Y染色体微缺失筛查方法，以实现临床快速检测和规模化筛查。本发明利用复合PCR扩增体系联合毛细管电泳法直接检测人基因组DNA，在一个反应管中可以同时对20个遗传标记进行检测，最终得到直观化检测结果。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种成本低、效率高、通量大的能够对人Y染色体微缺失进行多重PCR的扩增系统，以及检测试剂盒。本发明第一方面提供了一种用于人Y染色体微缺失20个遗传标记的多重PCR扩增系统，其中20个遗传标记包括15个Y染色体微缺失检测STS位点：AZFa区的sY84、AZFa区的sY86、AZFa区的sY182、AZFa区的sY81、AZFb区的sY121、AZFb区的sY134、AZFb区的sY127、AZFb区的sY105、AZFc区的sY255、AZFc区的sY254、AZFc区的sY242、AZFc区的sY154、AZFc区的sY1291、AZFd区的sY145、AZFd区的sY152；3个样本分子标签位点：SID1(DEFB126)、SID2(DXS7132)、SID3(DXS6809)；以及2个性别质控位点：SRY(sY14)、ZFX/Y；上述20个遗传标记相对应的引物在同一PCR扩增体系相互兼容，同时扩增各自目的片段；20个位点相应的PCR扩增引物及其荧光标记见表1。本发明所述的PCR扩增系统中，20个遗传标记的PCR扩增产物长度相互不重叠。调整各PCR引物工作浓度，使之在之间，同一组内纯合子间或杂合子间片段峰高相差在40％以内。本发明所述的PCR扩增系统中，引物由SEQIDNo.1至SEQIDNo.40所示寡核苷酸序列的PCR引物的干粉或溶液组成。表1.20个遗传标记40条PCR扩增引物与荧光素标记特征本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述PCR扩增系统用于人Y染色体微缺失的非诊断检测方法，包括使用本发明第一方面所述PCR扩增系统检测人外周血DNA的步骤。本发明第三方面提供了本发明第一方面所述PCR扩增系统在制备检测人Y染色体微缺失检测试剂盒中的用途。本发明第四方面提供了一种人Y染色体微缺失多重检测试剂盒，其包含含有本发明第一方面所述PCR扩增系统的容器、PCR反应母液容器和PCR辅助液容器；其中：所述PCR扩增系统中序列为SEQIDNo.1至SEQIDNo.40的引物以贮存液形式存在，贮存液浓度为相应工作浓度的2～10倍；所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2～5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含酶活为0.5～5U的DNA聚合酶、浓度为1～5mmol/L的镁离子、浓度为40～400μmol/L的dNTP及浓度为20～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液。所述PCR辅助液容器内含有PCR辅助液，该辅助液使上述复合PCR系统能够以人DNA为检测底物，实现上述20个基因位点在一个PCR管内同时反应。该PCR辅助液为可使所述PCR以DNA为扩增模板进行相应位片段扩增的缓冲体系，该缓冲体系以PBS为基液，包含甜菜碱(浓度为1～2M)、(NH4)2SO4(浓度为10～30mM)以及DMSO(浓度为2％～8％)。本发明第五方面提供了一种本发明第四方面所述检测试剂盒的使用方法，具体如下：(1)多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：(2)PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共28个循环，然后60℃保温40分钟，然后4℃保温；(3)PCR产物取1μL，按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳，得到每一个遗传标记的电泳图谱。本发明第六方面提供了一种本发明第四方面所述检测试剂盒在非诊断性检测人Y染色体微缺失中的用途。本发明的有益效果：本发明实现了一次PCR反应同时完成所述20个人Y染色体微缺失位点的多重检测，并且，本发明所提供的检测系统包含3个样本分子标签位点，可有效规避同批次检测中潜在的样本混淆问题，并确保多重体系中的15个Y染色体微缺失STS位点在一个反应中扩增均衡，分型图谱良好。同时，依据本发明所提供的性别质控位点，能实现联合分子标签位点对样本有无发生Y染色体完全缺失的判断，大大节省成本、人力和时间，显著提高了工作效率。附图说明图1为本发明试剂盒检测正常男性样本毛细管电泳图谱。图谱显示AZFa、AZFb、AZFc与AZFd均没有发生缺失、内控正常。图2为本发明试剂盒检测女性样本毛细管电泳图谱。图谱显示内控正常且没有发现Y染色体对应扩增信号。图3为本发明试剂盒检测AZFa区缺失男性样本毛细管电泳图谱。图谱显示AZFa区发生缺失，AZFb、AZFc、AZFd以及内控正常。图4为本发明试剂盒检测AZFb区缺失男性样本毛细管电泳图谱。图谱显示AZFb区发生缺失，AZFa、AZFc、AZFd以及内控正常。图5为本发明试剂盒检测AZFbcd区缺失男性样本毛细管电泳图谱。图谱显示AZFb、AZFc和AZFd区发生缺失，AZFa以及内控正常。具体实施方式为更好的理解本发明的内容，下面以男性基因组DNA为样本对人Y染色体微缺失多重检测试剂盒的具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本发明PCR反应体系试剂中的引物组合物所包括的核苷酸序列为SEQIDNo.1至SEQIDNo.40的引物为发明人通过引物设计，由DNA合成公司按照本领域所通用的常规合成方法合成的，然后将其配制为工作浓度100～350nmol/L。在本实施例中扩增反应在ABI9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDv3.2软件。所使用其它试剂和材料如内标、POP7、毛细管电泳缓冲液、Hi-Di均为本领域技术人员常用的常规材料。实施例1：DNA提取后测定OD值及浓度：DNA按照相关提取试剂盒(QIAGEN公司的人外周血基因组抽提试剂盒)的操作提取后进行OD值测定，DNA质量满足要求：1.6≤OD260/OD280≤2.0，DNA浓度稀释至1.0ng/μL的工作浓度备检。2：PCR体系配制按以下体系配制PCR反应体系(总反应体系为20μL)：在试剂盒中取出引物组合物容器、PCR反应母液容器。按总反应数乘以上述反应体系中单个反应需要量分别计算出所需要的PCR反应母液量、引物组合物量、PCR辅助液量和ddH2O量，在一个1.5mLEP管中将上述试剂混均匀，在按每个PCR反应管19μL进行分装、编号，然后按样本编号分别加入样本DNA模板1μL，并再次混匀。3：PCR反应采用ABI9700PCR仪进行PCR反应。PCR条件如下：95℃10分钟启动后，94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共28个循环，然后60℃保温40分钟，然后4℃保温。4：毛细管电泳分型检测(1)取(1μL内标+10μLHi-Di)×(样品数+1)配成混合液，混合后按每管10μL分装在96孔板板孔中。(2)取1μLPCR产物按样本编号加入相应的96孔板孔中。(3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟。(4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，按常规参数进行毛细管电泳(参见遗传分析仪厂商操作说明书)。(5)毛细管电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到分型图谱。5：数据分析在312例无关个体男性样本，Y染色体不同亚区微缺失检测结果如下表所示(表2)。表2.312例无关个体人群中不同缺失类型检出率(％)检测结果结果计数占比AZFa10.3％AZFb31.0％AZFc113.5％AZFd10.3％AZFa+b+c+d103.2％AZFb+c+d72.2％AZFc+d3310.5％无缺失25882.6％如图1中图谱所示，对于性别质控位点：SRY出现目的片段扩增产物峰，表明该样本有Y染色体，ZFX/Y位点出现双峰(双峰等高)，表明该样本同时存在X染色体与Y染色体，提示样本性别质控正常；对于分子标签位点：SID1出现目的扩增产物等高双峰(常染色体DEFB126杂合型)，SID2(DXS7132)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，SID3(DXS6809)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，提示分子标签兼内控正常；对于微缺失位点：AZFa区4个STS出现4个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFa区没有发生微缺失；AZFb区4个STS出现4个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFb区没有发生微缺失；AZFc区5个STS出现5个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFc区没有发生微缺失；AZFd区2个STS出现2个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFd区没有发生微缺失。因此可以得出结论：提示该样本为男性，且没有发生Y染色体微缺失。如图2中图谱所示，对于性别质控位点：SRY没有出现目的片段扩增产物峰，表明该样本没有Y染色体，ZFX/Y位点出现X染色体长片段单峰，表明该样本只存在X染色体，提示样本性别质控正常；对于分子标签位点：SID1出现目的扩增产物等高双峰(常染色体DEFB126杂合型)，SID2(DXS7132)出现目的扩增产物双峰(女性样本基因组中有两条X染色体)，SID3(DXS6809)出现目的扩增产物双峰(女性样本基因组中有两条X染色体)，提示分子标签兼内控正常；对于微缺失位点：AZFa区4个STS、AZFb区4个STS、AZFc区5个STS以及AZFd区2个STS均未出现目的片段扩增产物峰，表明该样本没有Y染色体信号。因此可以得出结论：提示该样本为女性，不存在Y染色体信号。如图3中图谱所示，对于性别质控位点：SRY出现目的片段扩增产物峰，表明该样本有Y染色体，ZFX/Y位点出现双峰(双峰等高)，表明该样本同时存在X染色体与Y染色体，提示样本性别质控正常；对于分子标签位点：SID1出现目的扩增产物单峰(常染色体DEFB126纯合型)，SID2(DXS7132)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，SID3(DXS6809)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，提示分子标签兼内控正常；对于微缺失位点：AZFa区4个STS只出现2个目的片段扩增产物峰(sY182和sY81)，另外2个未出现目的片段扩增产物峰(sY84和sY86)，表明该样本AZFa区发生微缺失；AZFb区4个STS出现4个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFb区没有发生微缺失；AZFc区5个STS出现5个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFc区没有发生微缺失；AZFd区2个STS出现2个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFd区没有发生微缺失。因此可以得出结论：提示该样本为男性，且发生Y染色体AZFa缺失。如图4中图谱所示，对于性别质控位点：SRY出现目的片段扩增产物峰，表明该样本有Y染色体，ZFX/Y位点出现双峰(双峰等高)，表明该样本同时存在X染色体与Y染色体，提示样本性别质控正常；对于分子标签位点：SID1出现目的扩增产物单峰(常染色体DEFB126纯合型)，SID2(DXS7132)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，SID3(DXS6809)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，提示分子标签兼内控正常；对于微缺失位点：AZFa区4个STS出现4个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFa区没有发生微缺失；AZFb区4个STS出现1个目的片段扩增产物峰(sY105)，其他3个STS未出现目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFb区发生微缺失；AZFc区5个STS出现5个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFc区没有发生微缺失；AZFd区2个STS出现2个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFd区没有发生微缺失。因此可以得出结论：提示该样本为男性，且发生Y染色体AZFb缺失。如图5中图谱所示，对于性别质控位点：SRY出现目的片段扩增产物峰，表明该样本有Y染色体，ZFX/Y位点出现双峰(双峰等高)，表明该样本同时存在X染色体与Y染色体，提示样本性别质控正常；对于分子标签位点：SID1出现目的扩增产物单峰(常染色体DEFB126纯合型)，SID2(DXS7132)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，SID3(DXS6809)出现目的扩增产物单峰(男性样本基因组中只有一条X染色体)，提示分子标签兼内控正常；对于微缺失位点：AZFa区4个STS出现4个目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFa区没有发生微缺失；AZFb区4个STS出现1个目的片段扩增产物峰(sY105)，其他3个STS未出现目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFb区发生微缺失；AZFc区5个STS未出现目的片段扩增产物峰，表明该样本AZFc区发生微缺失；AZFd区2个STS只出现1个目的片段扩增产物峰(sY145)，表明该样本AZFd区发生微缺失。因此可以得出结论：提示该样本为男性，且发生Y染色体AZFbcd缺失。本发明所提出的人Y染色体微缺失多重检测试剂盒可在具有PCR仪以及遗传分析的实验室稳定实施，检测时间为2～3小时。同时，本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构、专业医疗机构用于检测，具备产业化以及推广应用的条件。本发明已参照其特定的实施例作了描述。对于本领域技术人员而言，依据前面的描述，可能对本发明做各种修改或变换，包括(但不仅限于)：改变不同组别的荧光素标记，改变荧光素标记的引物(如由标记上游引物改变为标记下游引物)，依据各遗传标记扩增片段范围改变检测的分组排布，依据其它的PCR反应母液对PCR扩增条件、引物反应浓度进行优化，以及改变所推荐的反应体系等。很显然，上述修改或变换对于本领域技术人员而言都是可能的，但这些修改和变换并不背离本发明的精神和范围。当前第1页1 2 3