本发明属于光子晶体领域，尤其涉及一种制备基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的方法。
背景技术：
白血病是十大恶性肿瘤之一，它是一种血液系统的恶性肿瘤，虽然对其诊疗取得了重大的进步，其五年生存率也得到了很大的提高，但其发病率和死亡率仍然处在较高水平，并且在我国呈现递增趋势，因此白血病的防治工作仍然是我国公共卫生事业所面临的重大课题。白血病的主要治疗手段是化疗、靶向药物治疗、干细胞移植和免疫治疗。其中，药物治疗是白血病治疗的基石。造血干细胞移植之前需要化疗诱导缓解。靶向药物治疗能够大大提高治疗效率和减少副反应，如酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓细胞白血病(cml)。近年来无论是化疗还是靶向药物治疗，都取得了较大的进展，因此药物治疗在白血病治疗中的作用越来越大。然而药物治疗难免会遇到一个难题，即肿瘤的药物耐药，它是指肿瘤细胞对药物不敏感或者药物接触后对药物的敏感性下降甚至消失，致使药物对该肿瘤的疗效降低或无效，包括原药耐药(primarydrugresistance，pdr)和多药耐药(multidrugresistance，mdr)，其中mdr的危害更大，治疗更加困难。临床上证实无论是化疗药物还是靶向治疗药物，都存在肿瘤耐药的现象。对于白血病而言，一旦因为药物耐药而错过最佳治疗时机，它将会朝难治复发的方向发展，其治疗会更加困难，即使是使用造血干细胞移植，其成功率也会大大降低。因此，如果能够在肿瘤治疗前检测到肿瘤的耐药性或者在肿瘤的治疗过程中监测肿瘤的耐药性变化，及时更换药物或者加用肿瘤耐药逆转剂或者联合用药，那么不仅可以大大提高药物的疗效，而且还能减少不必要的副反应，对白血病的治疗具有重要的意义。
白血病的耐药机制包括abc转运蛋白介导的多药耐药、细胞凋亡耐受以及基因突变等，然而没有一种耐药机制可以解释所有耐药现象，并且针对一种耐药机制的耐药逆转也会存在失效的现象。因此对新的耐药机制的检测和其逆转点的研究，有利于白血病的治疗。如辛辛那提儿童医院医学中心的研究人员表明，阻断肿瘤细胞对化疗产生耐药和抵抗性的两种信号蛋白c-fos和dusp1的联合治疗可能治愈多种由激酶驱使的难治性白血病，其中包括急性髓性白血病(aml)和cml。对耐药检测和机制的研究，有效的检测方法至关重要。现有的对肿瘤耐药的检测的方法主要包括流式细胞技术检测耐药蛋白、rtpcr耐药基因检测、原位杂交、药物吞噬功能实验等，由于其早期耐药表达水平不高，加之这些技术存在过程复杂和不能直接捕获耐药细胞，因此基于这些策略的耐药检测效率不高，早期检测能力差。
能够直接抓捕耐药细胞和简化检测过程是提高耐药检测效率、实现早期耐药检测的重要途径。环肿瘤细胞(circulatingtumorcells，ctcs)是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，来源于原发肿瘤或转移肿瘤，从原发部位脱落进入循环系统，被认为是肿瘤转移的来源和肿瘤死亡的主要原因，近年来受到越来越多的关注。ctcs的特点是特异性高，假阳性低，是一种更为直接的和准确的肿瘤标志物，可以说只要发现ctcs的存在，就为肿瘤的确诊提供了有力证据，所以被称为肿瘤的液态活检(liquidbiopsyoftumors)。同时ctcs脱落较早，很多肿瘤在2-4mm的情况下已经有肿瘤细胞进入血液循环，是早期检测肿瘤的基础。ctcs在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色，并且处于不断变化的状态，其对药物的敏感性是肿瘤药物治疗效果的指示针，对治疗前选择何种药物、治疗中是否需要更换药物起着决定性作用。因此耐药ctcs检测有着非常诱人的应用前景。然而ctcs的含量本身就不高，即使是髓性白血病患者体内白血病细胞丰富，但是要在早期就将耐药的ctcs抓捕检测出来同样非常困难。目前使用ctcs抓捕检测方法主要有两种：一是基于形态学的富集分离法，如根据其ctcs形状大小和密度的特点进行分离富集；另外一种方法，也是目前多用的一种方法是根据ctcs表面的分子特点，使用上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)抗体，细胞角蛋白抗体或者适配体来富集和分离ctcs，如已经被美国fda批准的cellsearch系统，也是目前唯一被fda批准的ctcs检测上市系统，就是基于epcam的免疫磁性原理富集分离系统，同时还能够自动检测ctcs。然而这些ctcs的富集分离方法操作复杂，价格昂贵，并且存在失效的问题。如cellsearch系统对于非小细胞肺癌ctcs的检测很无力，甚至还没有基于大小的分离方法(size-basedisolationtechnique，iset)效率高。推测其原因，可能是基于epcam的富集分离方法是针对上皮肿瘤细胞的表面标志，而ctcs在脱离原发部位的过程中或者脱离后存在上皮细胞向间充质细胞转化问题，因此会存在失效的问题。更重要的是，这些检测方法不能直接检测耐药的ctcs，对于所抓捕的ctcs还需要后续一系列复杂的程序才能确定其耐药性。因此，要实现耐药ctcs的抓捕和检测，还需要开发其他的更有效的方法。
其中，对于稀少ctcs的抓捕和检测，近年来使用基于叶酸受体(folatereceptor，fr)和/或纳米材料的策略越来越受到重视。fr是细胞摄取叶酸的重要途径，其机制为受体介导的内吞效应，它具有亲和力高、特异性强的特点，并且fr在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性。利用fr在肿瘤广泛性高表达的特点以及叶酸-fr之间的高特异性，科研工作者开发了许多ctcs富集检测系统。这些富集检测系统多是将叶酸或者fr抗体修饰在一定的载体上，这些载体也是多种多样，其中以纳米材料的研究报道居多。纳米材料由于其结构和性质上的优势，在ctcs的抓捕应用上越来越多，如将之作为适配体、抗体分子的载物，同样也有报道将之作为叶酸分子的载体，实现对ctc的抓捕和检测。但采用纳米材料作为载体，难以在拥有良好的生物兼容性的同时保持结构稳定，因此基于这些载体的ctcs捕捉效率有限并且对ctcs造成的伤害较大。
因此，现亟需一种能够制备特异、灵敏、准确地抓捕髓性白血病耐药细胞的复合材料的方法。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是提供一种制备基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的方法，该方法过程简单容易，对设备要求低，且制备的复合材料不仅生物兼容性优、比表面积大，且机械强度高、稳定性强、易于操控。
技术方案：本发明制备基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的方法，包括如下步骤：
(1)分别配制含聚乙二醇双丙烯酸酯的预凝胶a，含甲基丙烯酸酯明胶和磁性纳米粒子的预凝胶b；
(2)采用二氧化硅胶体微球作为模板，并将其置于反应管中，加入预凝胶a反应30～60min，聚合20～60s后，去除二氧化硅胶体微球，制得聚乙二醇双丙烯酸酯反蛋白石骨架；
(3)将预凝胶b加入反蛋白石骨架中反应30～60min，聚合20～60s后，即制得混合光子晶体；
(4)配制叶酸-二甲基亚砜混合溶液，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在30～40℃条件下反应5～15min，加入上述混合光子晶体和n-羟基琥珀酰亚胺反应10～12h后，洗涤，即可制得该复合材料，其中，叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:2～3:4～6。
本发明的以混合光子晶体为载体，在其表面负载叶酸，过程简单容易，对设备要求低，制得的复合材料不仅具有纳米的有序结构、比表面积大，且混合光子晶体先通过采用聚乙二醇双丙烯酸酯构成骨架结构，聚合后具有优越的机械强度，有效提高了复合材料的稳定性，同时，在骨架结构的孔隙中填充甲基丙烯酸酯明胶，提高了该复合材料的生物兼容性，且含有丰富的氨基，能够高效地将叶酸通过羧基-氨基反应修饰到该光子晶体上，并达到均匀高密度的效果；此外，在骨架结构中还填充磁性纳米粒子，能够使得复合材料具有优越的磁性响应性，能够更优地被磁性分离，易于操控。优选的，复合材料中甲基丙烯酸酯明胶和磁性纳米粒子的质量比为4000:1～3，倘若磁性纳米粒子加入量过多，则导致甲基丙烯酸酯明胶聚合不完全，进而影响该混合光子晶体的生物兼容性及对耐药细胞的抓捕能力，而加入量过少，则使得该混合光子晶体的操控性减弱。磁性纳米粒子优选可为羧基化四氧化三铁磁性纳米颗粒，其能够易于与甲基丙烯酸酯明胶结合为一体，提高了混合光子晶体的整体性，进而提高了其综合力学性能。
进一步说，步骤(1)中，预凝胶a按体积百分比包括聚乙二醇双丙烯酸酯70～90％、光引发剂1～2％及水9～28％。预凝胶b按体积百分比包括甲基丙烯酸酯明胶、磁性纳米粒子悬浮液、光引发剂及水，其中磁性纳米粒子悬浮液、水及光引发剂的体积比为2～3:60～80:1。
再进一步说，步骤(2)中，聚合20～60s后，将二氧化硅胶体微球置于水中20～40min后，剥离表面的胶体后再将其去除。步骤(3)中，聚合20～60s后，将反蛋白石骨架先置于60～80℃热水中，随后置于冰水中剥离其表面的胶体。步骤(4)中，叶酸-二甲基亚砜混合溶液中叶酸的浓度为5～8mg/ml。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：该制备方法以混合光子晶体为载体，在其表面负载叶酸，过程简单容易，对设备要求低，环境友好，制得的复合材料不仅具有纳米的有序结构、比表面积大，且机械强度高、稳定性强，同时还具有优越的生物兼容性和磁性响应性，易于操控，将其应用于耐药细胞的检测，能够特异、灵敏、简单、有效地抓捕到髓性白血病耐药细胞，并保持要细胞株具有良好的生物活性，抓捕后只需施加磁场即可有效地对其进行富集、分离。
附图说明
图1为本发明的混合光子晶体的制备流程图；
图2为本发明的二氧化硅胶体微球的电镜图；
图3为本发明的二氧化硅胶体微球的光镜图；
图4为本发明的聚乙二醇双丙烯酸酯反蛋白石骨架的电镜图；
图5为本发明的聚乙二醇双丙烯酸酯反蛋白石骨架的光镜图；
图6为本发明的混合光子晶体的电镜图；
图7为本发明的混合光子晶体的光镜图；
图8为对本发明的混合光子晶体施加磁场的效果图；
图9为对本发明的混合光子晶体去除磁场的效果图；
图10为叶酸修饰混合光子晶体复合材料的傅里叶红外表征图；
图11为无叶酸修饰混合光子晶体复合材料的fitc标记的叶酸多克隆抗体表征图；
图12为本发明的叶酸修饰的混合光子晶体的fitc标记的叶酸多克隆抗体表征图；
图13为a02细胞的fa-fitc结合能力流式细胞技术结果图；
图14为k562细胞的fa-fitc结合能力流式细胞技术结果图；
图15为叶酸修饰混合光子晶体复合材料对髓性白血病耐药细胞抓捕方法原理图；
图16为叶酸修饰混合光子晶体复合材料对a02细胞的捕捉图；
图17为叶酸修饰混合光子晶体复合材料对k562细胞的捕捉图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
二氧化硅胶体微球(sccbs)的制备：
(1)将sio2纳米粒子超声1h后，在8000rpm条件下离心10min，去除上清液后加入超纯水，重复以上步骤20次。
(2)将上述清洗后的sio2纳米粒子配制成质量分数为20％的乳液，超声30min。
(3)在收集器和油相注射器中加入适量的正十六烷(含有1％hypermer2296表面活性剂)，45℃预热，调节油相速度2ml/h和水相速度1ml/h；其中，正十六烷的液量：距离收集器底部的距离约为0.3cm，倘若量多，则小球容易飘动相互融合，量少则小球不处于悬浮状态导致塌陷；油相注射器的正十六烷量为水相总液量的三倍以上，以确保制备过程中油相充足即可。
(4)将上述单分散性乳液置于60℃条件下加热过夜，以蒸干液滴中的水分。
(5)将温度升至90℃加热5h，以完全蒸干液滴中的水分，微球呈现结构色。
(6)将微球转移至坩埚中放入箱式炉中，先以175min升至800℃，保持240min，随后240min降至30℃煅烧，以提高其机械强度。
基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的制备：
(1)配制预凝胶a：聚乙二醇双丙烯酸酯80％、光引发剂1％及水19％；配制预凝胶b：甲基丙烯酸酯明胶(gelma)、铁浓度为4mg/ml磁性纳米粒子悬浮液、光引发剂及水，其中，磁性纳米粒子悬浮液、水及光引发剂的体积比为2.5:80:1，磁性纳米粒子为羧基化四氧化三铁磁性纳米颗粒。
(2)制备聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)的反蛋白石骨架：将装有sccbs的透明塑料离心管用锡箔纸包裹，滴加预凝胶a至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止60min，使得预凝胶a充分浸入sccbs的孔隙；随后采用紫外光聚合60s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀，聚合后将透明塑料离心管剪开，置于含有超纯水的小皿中20～40min，将sccbs与其表面的胶体块完全分离；最后将sccbs置于0.5ml的离心管中，加入5％的氢氟酸200ul，腐蚀24h去除sccbs模板，制得pegda的反蛋白石骨架。
(3)制备混合光子晶体：先将上述制备的pegda的反蛋白石骨架置于0.2ml的透明塑料离心管中，75℃烘箱烘干，采用锡箔纸包裹，滴入预凝胶b至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止60min，使得预凝胶b充分浸入骨架的空隙中；随后采用紫外光聚合60s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀；最后将pegda反蛋白石结构光子晶体先置于60～80℃热水中1min，随后置于冰水中1min，利用体积变化差将其余外面的胶体块分离，制得混合光子晶体，制备过程如图1所示。
(4)制备叶酸修饰的复合材料：称量0.03g叶酸溶解在5ml二甲基亚砜(dmso)溶液中，震荡使其充分溶解，加入30mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，在37℃、300rpm条件下反应10min；加入混合光子晶体微球及50mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，避光过夜后，采用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗5次，去除多于的叶酸和活化剂(edc和nhs)，即可制得混合光子晶体载体上负载叶酸的复合材料，该复合材料中甲基丙烯酸酯明胶和磁性纳米粒子的质量比为2000:1。
将该实施例制得的二氧化硅胶体微球进行结构表征，获得的结果如图2及图3所示，制备的二氧化硅胶体微球呈现纳米有序的结构，大小均一，直径约为290um，反射峰明显，结构色明亮，中心亮点突出。
将该实施例制得的pegda的反蛋白石骨架进行结构表征，获得的结果如图4及图5可知，制备的聚乙二醇双丙烯酸酯反蛋白石骨架呈现纳米有序的结构，由正六边形的框架结构组成，大小均一，直径约为330um，比其模板二氧化硅光子晶体的直径稍大一点，结构色明亮，中心亮点突出。
将该实施例制得的混合光子晶体进行结构表征，获得的结果如图6及图9所示。通过图6和图7所示，制备的混合光子晶体呈现纳米有序的结构，由正六边形的框架结构和其内部的填充成分组成，框架结构为pegda凝胶聚合物，而填充成分为gelma凝胶与磁性纳米粒子的聚合物，大小均一，直径约为330um，与pegda的反蛋白石光子晶体基本一样大，结构色明亮，中心亮点突出。通过图8及图9所示，施加磁场以后，混合光子晶体能够稳定的贴在瓶子的侧壁不落下，并且聚集在磁铁磁场强的区域；而去除加磁场以后，混合光子晶体逐渐落下，落在瓶底处，证明该混合光子晶体具有良好的磁性响应性，在磁场的控制下很容易对其进行收集。
将该实施例制备的复合材料进行性能结构表征，获得的结果如图10至12所示。叶酸分子上具有活泼的羧基(分子式如下式ⅰ所示)，gelma凝胶上含有丰富的氨基和羧基(分子式如下式ⅱ所示)，本发明能够将叶酸通过羧基-氨基反应形成酰胺键而修饰到本发明的混合光子晶体上，且修饰均匀。
将上述制备的复合材料应用于髓性白血病耐药细胞的检测，具体包括如下步骤：
(1)将处于对数生长期的肿瘤细胞计数，配置成1～9×106cells/ml的细胞浓度的悬液。
(2)取上述细胞悬液0.1ml加入96孔板，将复合材料置于孔板中，放置细胞培养箱在37℃条件下培养90min，每隔10min将96孔板轻轻摇晃，以增加其与细胞的接触机会。
(3)采用倒置显微镜、共聚焦显微镜对上述捕捉后的复合材料进行检测。
(4)捕捉后加以磁场收集该复合材料，并用pbs小心冲洗一次后加入少量0.25％胰酶，立即光镜下观察消化过程，进行cck8等相关活性表征即可。
本发明的复合材料的捕捉原理及效果如图13至17所示。耐药髓性白血病细胞的叶酸受体表达较高(图13和14)，因而可以通过这种叶酸修饰混合光子晶体将耐药的髓性白血病细胞捕获。先通过氨基和羧基的酰胺反应将叶酸修饰混合光子晶体上，之后利用叶酸和叶酸受体之间的高亲和力，即可有效地抓捕叶酸受体高表达的肿瘤细胞。
实施例2
二氧化硅胶体微球(sccbs)的制备：
步骤与实施例1相同。
基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的制备：
(1)配制预凝胶a：聚乙二醇双丙烯酸酯70％、光引发剂2％及水28％；配制预凝胶b：甲基丙烯酸酯明胶(gelma)、铁浓度为4mg/ml磁性纳米粒子悬浮液、光引发剂及水，其中，磁性纳米粒子悬浮液、水及光引发剂的体积比为2:60:1，磁性纳米粒子为羧基化四氧化三铁磁性纳米颗粒。
(2)制备聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)的反蛋白石骨架：将装有sccbs的透明塑料离心管用锡箔纸包裹，滴加预凝胶a至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止45min，使得预凝胶a充分浸入sccbs的孔隙；随后采用紫外光聚合20s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀，聚合后将透明塑料离心管剪开，置于含有超纯水的小皿中20～40min，将sccbs与其表面的胶体块完全分离；最后将sccbs置于0.5ml的离心管中，加入5％的氢氟酸200ul，腐蚀24h去除sccbs模板，制得pegda的反蛋白石骨架。
(3)制备混合光子晶体：先将上述制备的pegda的反蛋白石骨架置于0.2ml的透明塑料离心管中，75℃烘箱烘干，采用锡箔纸包裹，滴入预凝胶b至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止45min，使得预凝胶b充分浸入骨架的空隙中；随后采用紫外光聚合20s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀；最后将pegda反蛋白石结构光子晶体先置于60～80℃热水中1min，随后置于冰水中1min，利用体积变化差将其余外面的胶体块分离，制得混合光子晶体，该混合光子晶体中甲基丙烯酸酯明胶和磁性纳米粒子的质量比为4000:1。
(4)制备叶酸修饰的复合材料：称量0.025g叶酸溶解在5ml二甲基亚砜(dmso)溶液中，震荡使其充分溶解，加入0.05g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，在30℃、300rpm条件下反应15min；加入混合光子晶体微球及0.1gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，混合光子晶体微球完全沉浸在混合溶液中，避光过夜后，采用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗5次，去除多于的叶酸和活化剂(edc和nhs)，即可制得混合光子晶体载体上负载叶酸的复合材料。
实施例3
二氧化硅胶体微球(sccbs)的制备：
步骤与实施例1相同。
基于叶酸修饰的混合光子晶体复合材料的制备：
(1)配制预凝胶a：聚乙二醇双丙烯酸酯90％、光引发剂1％及水9％；配制预凝胶b：甲基丙烯酸酯明胶(gelma)、铁浓度为4mg/ml磁性纳米粒子悬浮液、光引发剂及水，其中，性纳米粒子悬浮液、水及光引发剂的体积比为3:80:1。
(2)制备聚乙二醇双丙烯酸酯(pegda)的反蛋白石骨架：将装有sccbs的透明塑料离心管用锡箔纸包裹，滴加预凝胶a至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止30min，使得预凝胶a充分浸入sccbs的孔隙；随后采用紫外光聚合40s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀，聚合后将透明塑料离心管剪开，置于含有超纯水的小皿中20～40min，将sccbs与其表面的胶体块完全分离；最后将sccbs置于0.5ml的离心管中，加入5％的氢氟酸200ul，腐蚀24h去除sccbs模板，制得pegda的反蛋白石骨架。
(3)制备混合光子晶体：先将上述制备的pegda的反蛋白石骨架置于0.2ml的透明塑料离心管中，75℃烘箱烘干，采用锡箔纸包裹，滴入预凝胶b至恰好完全覆盖，适当摇晃，于室温下静止30min，使得预凝胶b充分浸入骨架的空隙中；随后采用紫外光聚合40s，聚合过程中匀速翻转离心管，让其聚合均匀；最后将pegda反蛋白石结构光子晶体先置于60～80℃热水中1min，随后置于冰水中1min，利用体积变化差将其余外面的胶体块分离，制得混合光子晶体，该混合光子晶体中甲基丙烯酸酯明胶和磁性纳米粒子的质量比为4000:3。
(4)制备叶酸修饰的复合材料：称量0.04g叶酸溶解在5ml二甲基亚砜(dmso)溶液中，震荡使其充分溶解，加入0.12g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，在40℃、300rpm条件下反应5min；加入混合光子晶体微球和0.24gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，避光过夜后，采用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗5次，去除多于的叶酸和活化剂(edc和nhs)，即可制得混合光子晶体载体上负载叶酸的复合材料。
将实施例2和实施例3制备的复合材料进行性能检测可知，不仅具有纳米的有序结构、比表面积大，且机械强度高、稳定性强，同时还具有优越的生物兼容性和磁性响应性，易于操控。在其表面负载叶酸制得复合材料应用于耐药细胞的检测，能够特异、灵敏、简单、有效地抓捕到髓性白血病耐药细胞，且抓捕后只需施加磁场即可有效地对其进行富集、分离。此外，本发明采用的光引发剂为光引发剂hmpp，采用的原料均购自市售。